[研究背景及目的]肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常见的消化系统肿瘤之一。尽管近30年来HCC的诊断与治疗已取得了较大进展,但是其预后并未得到根本改善。因此,深入研究HCC发生、发展及其耐药机制,寻找有效的治疗靶点是研究人员亟需攻克的难题。随着肿瘤研究不断深入,研究人员发现肿瘤细胞并不是“孤军奋战”,他们可以招募周围间质细胞形成一个新的整体,我们称之为肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)。肿瘤微环境是由肿瘤细胞、细胞外基质(extracellular matrix, ECM).多种间质细胞及其分泌的蛋白组成。间质中的细胞成分主要分为三类：血管相关细胞(angiogenic cells)、免疫细胞(immune cells)及肿瘤相关成纤维细胞(tumor associated fibroblasts,TAFs)。越来越多的研究表明TAFs参与维持肿瘤的标志性特征,如增殖信号的持续活化、抵抗细胞死亡、维持细胞持续复制、诱导血管生成、促进增殖及转移、改变能量代谢等。同时,TAFs增加肿瘤细胞对化疗药物的抵抗能力。因此,靶向TAFs阻断其对肿瘤的“支持”作用是肿瘤治疗的新策略。基于以上研究背景,本研究主要探索TAFs对HCC发生、发展的作用。我们将从三个方面展开研究。首先,在人HCC组织中分离并纯化TAFs及癌旁成纤维细胞(peri-tumor fibroblasts,PTFs),利用细胞免疫化学及Real-time PCR检测TAFs与PTFs相关标记物的表达,研究二者生物学特性差异；在此基础上建立TAFs与肝肿瘤细胞株体外共培养系统,观察TAF对肝肿瘤细胞株增殖、侵袭、转移、成球、上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transformation,EMT)、皮下成瘤与转移等生物学效应的影响；进一步研究TAFs促进肿瘤恶性转化的机制,芯片检测并筛选TAFs与PTFs分泌差异的趋化因子,探讨趋化因子对TAFs与肝肿瘤细胞Cross-talk的作用并寻找相关信号转导通路。为HCC的临床治疗提供新的思路和方法。[实验方法]一、肝癌相关成纤维细胞的分离与鉴定1.分离并纯化TAFs与PTFs将人HCC组织与癌旁组织剪碎,胶原酶Ⅳ消化完全后梯度离心得到TAFs与PTFs,利用Anti-fibroblast磁珠纯化原代分离的成纤维细胞。2.鉴定TAFs与PTFs细胞免疫化学与Real-Time PCR检测TAFs与PTFs细胞α-SMA、Vimentin、FSP-1及EMT相关指标表达。3. TAFs与PTFs生物学特性的差异将不同TAFs与PTFs以3×103/孔的数量接种于96孔板中,每组设3个复孔,CCK-8每天检测TAFs与PTFs的增殖情况；将TAFs与PTFs消化并重悬于无血清DMEM中,以4×104/孔的数量接种于上层迁移小室,24小时后检测TAFs与PTFs的迁移情况。二、TAFs与PTFs对肝肿瘤细胞生物学特性的影响1.建立TAFs、PTFs与肝肿瘤细胞的共培养系统将’TAFs与PTFs置于0.4μm共培养小室中与下层肿瘤细胞共培养或收集TAFs与PTFs培养液上清(条件培养基Conditional medium,CM)直接培养肝肿瘤细胞。2. TAFs对肝肿瘤细胞株增殖、侵袭及迁移能力的影响建立TAFs与PTFs与肝肿瘤细胞的共培养系统,CCK-8检测TAFs与PTFs或其条件培养基(含3%FBS的DMEM培养成纤维细胞24小时)对不同肝肿瘤细胞株增殖能力的影响；将TAFs与PTFs (1×104)接种于24孔板底层,肝肿瘤细胞株LM3置于上层侵袭小室中,24小时后利用结晶紫对侵袭细胞进行染色,显微镜观察并拍照；将TAFs与PTFs细胞或条件培养基(含3%FBS的DMEM培养成纤维细胞24小时)置于24孔板底层,肝肿瘤细胞株接种于上层迁移小室中,24小时后利用结晶紫对迁移细胞进行染色,显微镜观察并拍照。3. TAFs对肝肿瘤细胞株上皮-间质转化的作用将2×105的Huh7细胞接种于35mm培养皿中,待其贴壁后更换培液为TAFs与PTFs条件培养基(含3%FBS的DMEM培养成纤维细胞24小时),Real-time PCR及细胞免疫荧光法检测EMT相关指标的表达。4. TAFs对肝肿瘤细胞株“干性”的影响TAFs与PTFs条件培养基处理(干细胞专用培养液培养成纤维细胞24小时)Huh7细胞48小时,Real-time PCR检测肿瘤干细胞(Cancer stem cell,CSC)以及自我更新相关基因在mRNA表达水平的变化；流式细胞仪分选Huh7细胞中Epcam阳性及阴性的细胞,将分选后的细胞以每孔10个细胞的数量加入低吸附的96孔板中(未分选的Huh7细胞作为对照),利用TAFs与PTFs条件培养基(干细胞专用培养液培养成纤维细胞24小时)处理细胞,7天和14天分别计数成球细胞,计算成球率。5.TAFs对肝肿瘤细胞株成瘤及转移能力的影响皮下成瘤实验：将TAFs与PTFs与人肝癌细胞株LM3按1：5制成混合细胞悬液(LM3:1×106,TAFs/PTFs:2×105),接种于裸鼠皮下,建立小鼠皮下成瘤模型,观察其皮下成瘤情况。体内转移实验：将luciferase标记的Huh7细胞与TAFs/PTFs以5：1的比例制成细胞混合悬液(Huh7:1×106,TAFs/PTFs:2×105),接种于NOD-SCID小鼠皮下,建立小鼠皮下转移模型,活体成像仪观察转移情况。三、TAF促进HCC恶性转化的机制1.芯片检测TAFs与PTFs趋化因子表达的差异收集三对TAFs与PTFs培养液上清(DMEM无血清培养24小时),采用Raybiotech试剂盒进行趋化因子表达谱的检测。筛选出表达差异明显的趋化因子；收集不同来源TAFs与PTFs的RNA(DMEM无血清培养24小时)验证芯片结果。2. Real-time PCR检测芯片结果中有变化的趋化因子及其受体的表达。检测三种趋化因子(CCL2、CCL5、CXCL16)对肝肿瘤细胞株Huh7迁移能力的影响。将趋化因子CCL2、CCL5、CXCL16以0.10、20、40ng/ml的浓度分别加入24孔板下层培养液(500μl含1%FBS的DMEM)中,在上层迁移小室中接种Huh7细胞(5×104),培养24小时后染色并拍照；收集PTFs与TAFs的条件培养基(含1%FBS的DMEM培养成纤维细胞24小时),将趋化因子CCL2、CCL5、CXCL16中和抗体以0.1、5μg/ml的浓度分别加入PTFs与TAFs的条件培养基中,混匀后以500μl／孔的体积加入24孔板。在上层迁移小室中接种Huh7细胞(5×104),培养24小时后染色并拍照。3.TAFs对肝肿瘤细胞株信号转导通路的影响Huh7细胞转染报告基因质粒(Wnt、Hippo、NF-κB、Hedgehog、TGF-β),转染后6小时将培养液更换为PTFs与TAFs的条件培养基(含1%FBS的DMEM培养成纤维细胞24小时),共培养24小时后检测荧光素酶表达情况。筛选出有变化的信号转导通路；将Huh7细胞(1×105)接种于35mm培养皿,贴壁后将培养液更换为PTFs与TAFs的条件培养基(含1%FBS的DMEM培养成纤维细胞24小时),24小时后收集RNA,Real-time PCR检测Hedgehog和TGF-β通路相关基因的表达。4.趋化因子对Hedgehog和TGF-β信号通路的影响Huh7细胞转染Hedgehog和TGF-β报告基因质粒,转染后6小时将培养液更换为无血清DMEM培养基,趋化因子CCL2、CCL5、CXCL16以0、5、10、20ng/ml浓度加入培养基中,检测Hedgehog和TGF-β通路的活化情况；利用PTFs与TAFs条件培养基(含1%FBS的DMEM培养成纤维细胞24小时)处理转染细胞,加入CCL2、CCL5、CXCL16中和抗体(0、1、5μg/ml),共培养24小时后,检测Hedgehog和TGF-β通路的活化情况；将Huh7细胞(1×105)接种于35mm培养皿,贴壁后利用无血清DMEM饥饿细胞12小时,趋化因子CCL2、CCL5、CXCL16以0、10、20ng/ml浓度加入培养基中,24小时后收集RNA,Real-time PCR检测Hedgehog和TGF-β通路相关基因的表达。四、统计学处理数据采用SPSS16.0统计软件包进行分析,结果以X±SD表示。多组间采用One-Way ANOVA分析,P<0.05为统计结果具有显著性差异。[实验结果]一、原代分离TAFs与PTFs的表型与生物学特性不同1.细胞免疫荧光结果显示PTFs与TAFs均表达α-SMA、Vimentin与FSP-1,其中α-SMA与FSP-1在TAFs中表达明显强于PTFs。但是Vimentin在二者之间表达未见差别。2. Real-Time PCR检测结果显示α-SMA、FAP、PDGF在TAFs中表达高于PTFs二、N-cadherin、Snail、Twist(P<0.05)；EMT间质相关指标TAFs在PTFs中表达高于E-cadherin(P<0.05),而上皮相关指标PTFs在3. TAFs中表达较高(P<0.05)。PTFs。的增殖能力与迁移能力高于TAFs促进肝肿瘤细胞恶性转化1.TAFs促进肝肿瘤细胞增殖、侵袭与迁移(1)成纤维细胞条件培养基处理LM3与Huh7细胞,结果发现TAFs促进肿瘤细胞株增殖作用明显高于PTFs与正常对照组；另外,不同TAFs的条件培养基与Huh7细胞共培养,Huh7细胞增殖出现不同程度的增加；TAF细胞与MHCC-H、SK-Hep1、 Huh7、PLC共培养,可显著促进不同肿瘤细胞株增殖。(2)侵袭实验结果显示,TAF细胞处理组LM3细胞的侵袭率为89.7%,高于PTFs处理组(66.3%)与对照组(39.1%)(P<0.05)。(3)迁移实验结果显示,不同来源TAFs条件培养基均可促进Huh7细胞迁移,其促迁移能力高于PTF组与对照组(P<0.05)；另外,TAFs增强肝肿瘤细胞MHCC-H、 SK-Hep1、Huh7、PLC细胞的迁移能力。2. TAFs促进肝肿瘤细胞发生上皮-间质转化TAFs条件培养基处理Huh7细胞,Real-time PCR结果显示Huh7细胞间质代表基因N-cadherin、Snail、Twist与a-SMA表达均上调(与PTFs组相比,P<0.01),而上皮代表基因E-cadherin表达下调(P<0.01)。细胞免疫荧光结果显示E-cadherin与Vimentin荧光强度在对照组、PTFs与TAFs组间未见明显差别,但是Vimentin阳性细胞比例在TAFs条件培养基处理组显著增多。3. TAFs增加肝肿瘤细胞的“干性”TAF条件培养基处理Huh7细胞,Real-time PCR结果显示CSC相关基因CD44、 CD90、CD133与Epcam表达均上调(P<0.05)；此外,自我更新相关基因Sox2、 Oct4、Nanog、Klf4表达亦明显上调(P<0.05)；利用流式细胞仪将Huh7细胞分为Epcam阳性与Epcam阴性两组,未分选的Huh7细胞作为对照,进行成球实验。结果显示TAFs条件培养基可以增加Epcam阳性、Epcam阴性以及未分选Huh7细胞的成球率,其中Epcam阳性细胞成球率增加最为明显,约为12%(P<0.05)。而PTFs对细胞成球能力无明显影响。4. TAFs增加肝肿瘤细胞的成瘤与转移能力成瘤实验：TAFs组裸鼠约在第6天开始出现肿瘤,PTFs组出现肿瘤的时间在第9天；21天后处死小鼠,结果显示TAFs组肿瘤瘤重与体积均大于PTFs组,说明TAFs促进肝肿瘤细胞成瘤的能力强于PTFs。转移实验：第七周将小鼠麻醉,腹腔注射荧光素钾,取出小鼠左侧上肢骨、肺、脾、肝、肾、脑进行荧光扫描,结果显示PTFs组5只小鼠有一只出现转移,而TAFs组7只小鼠有6只出现转移,说明TAFs可显著促进肿瘤细胞的迁移。三、 TAFs促进HCC恶性转化的机制1.TAFs与PTFs趋化因子表达不同芯片检测显示,TAFs培养上清中7种趋化因子含量明显于高PTFs。Real-time PCR证实CCL2(MCP-1)、CCL5(RANTES)、CXCL16在TAFs中表达显著高于PTFs组,其余4种(CCL7、CCL11、CXCL1、CXCL8)在二者之间未见明显变化,但是相关趋化因子受体在TAFs中表达均高于PTFs。另外,TAFs与Huh7细胞共培养后,Huh7细胞中CCL2、CCL5、CXCL16相应受体CCR2、CCR5与CXCR6的表达显著升高(P<0.05)。2.趋化因子CCL2、CCL5、CXCL16促进Huh7细胞迁移迁移实验结果显示：CXCL16促迁移作用最强,CCL2、CCL5促进迁移的能力相似,在20ng/ml浓度刺激下,迁移率约为30%(P<0.001)。同时,趋化因子CCL2、 CCL5、CXCL16中和抗体可部分阻断TAFs促进Huh7迁移的作用。3. TAFs激活肝肿瘤细胞Hedgehog和TGF-β通路五个被检测通路TGF-β、NF-κB、Wnt、Hippo)中只有Hedgehog与TGF-β在TAFs刺激后活化,其中TAFs处理组TGF-β通路明显活化,其荧光素酶表达为对照组的9倍,Hedgegog通路荧光素酶表达为对照组的2.5倍(P<0.01)；利用Real-time PCR检测TAFs是否激活Hedgehog和TGF-β通路下游基因,结果显示TAFs上调TGF-β通路smad-5与c-myc,Hedgehog通路下游基因Gli-1、Shh、Bcl-2亦可被TAFs活化。4.趋化因子对Hedgehog和TGF-P信号通路的影响报告基因检测趋化因子对通路的活化作用,结果发现CXCL16激活TGF-β通路,CCL2、CCL5活化Hedgehog通路。另外,CCL5、CXCL16中和抗体可分别阻断TAFs对Hedgehog与TGF-β通路的活化作用。提示TAFs对两个通路的活化作用部分通过CCL5、CXCL16实现。Real-time PCR检测趋化因子对通路下游基因的作用,结果显示CCL2、CCL5激活Hedgehog通路下游基因Shh、Bcl-2、Gli-1,CXCL16上调TGF-β通路c-myc与smad-5的表达。[结论]1.TAFs高表达a-SMA与FSP-1,其增殖和迁移能力高于PTFs。2. TAFs促进肝肿瘤细胞株的增殖、侵袭、迁移、体内成瘤及转移。3. TAFs促进肿瘤细胞的上皮-间质转化,维持肝肿瘤细胞的“干细胞特性”。4. CCL2、CCL5与CXCL16等TAFs分泌的趋化因子通过激活TGF-P与Hedgehog通路促进肿瘤细胞恶性转化。