肝脏是动物体内最大的腺体,也是最重要的器官之一,肝脏的功能极为复杂,有体内“化学工厂”之称,所以肝脏一旦发病就严重威胁人类的身体健康,也是人类因疾病死亡的主要原因之一。目前人们对于各种原因导致终末期肝病仍然没有有效的治疗措施,原位肝移植(orthotopic livet transplantation,OLT)成为了疾病治疗最后的保障,然而由于肝脏供体来源的短缺和可能发生免疫排斥反应的限制,肝移植的应用比较局限。肝细胞移植技术(hepatoeyte transplantation,HCT)是继原位肝移植技术后又一种治疗各种终末期危重肝病的方法,而且相对于OLT更具有优势,但同样也面临着细胞来源的问题,而目前作为体外支持治疗用的生物人工肝(bioartificial liver,BAL)也因为肝细胞来源问题而进展缓慢,如何进一步解决肝细胞的来源、数量和活力问题成为了开展HCT治疗和BAL技术的核心问题。胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ES细胞)具有无限增殖和三胚层多向分化的潜能,是再生医学重要的种子细胞,为各种损伤及退行性疾病的细胞治疗带来了新的希望,建立有效的定向诱导分化技术用于损伤和疾病组织的修复和替代治疗研究是目前ES细胞研究的重要方向。研究表明ES细胞可以在体内外成功地分化为肝细胞,这对于各种终末期肝病的细胞治疗提供了潜在无限的细胞来源,然而ES细胞诱导分化肝细胞的研究还处于初级阶段,目前主要模拟肝脏发育的机制,通过相关细胞因子或化合物、基因修饰和共培养的方式诱导ES细胞分化为肝细胞,技术复杂、分化效率低下、成本高。本研究使用小鼠胚胎干细胞系ES-D3细胞作为研究对象,建立了两步法单层诱导ES细胞分化为肝样细胞的方法,并对诱导分化所得的肝样细胞从形态学、基因表达、蛋白分子标记及细胞功能等方面进行了检测,证明了分化所得细胞为肝细胞,而且分化所得肝细胞脾脏移植到损伤小鼠肝脏后可以归巢并整合到小鼠损伤肝组织内；最后,利用建立的小鼠四氯化碳急性肝损伤模型,通过活体动物实验检测了人胎肝细胞系HL-7702作为生物人工肝细胞来源的潜力。　　 本研究共分为六个部分,第一、二和三部分进行了小鼠胚胎干细胞系ES-D3细胞的培养和诱导分化,并从细胞的形态结构、基因表达、蛋白分子标记及细胞功能方面进行了全面检测,诱导分化所得细胞为肝样细胞；同时对诱导分化过程中,丁酸钠导致的细胞凋亡现象和细胞周期分布进行了研究,表明EGF可以抑制细胞凋亡。第四部分通过灌胃的方法,建立了小鼠急性四氯化碳肝损伤模型；第五部分将体外DAPI标记的分化所得的ES-D3-Hep细胞通过脾脏注射的方法,移植到急性肝损伤小鼠体内,表明移植的ES-D3-Hep细胞可以整合到损伤的肝组织内。第六部分利用建立的小鼠急性四氯化碳肝损伤模型,过腹腔移植人胎肝细胞HL-7702,表明其作为生物人工肝的细胞来源具有潜在的价值。主要的研究结果如下:　　 第一部分在小鼠ES-D3细胞的培养及定向诱导分化为肝细胞的形态学观察试验中,以小鼠胚胎干细胞系mESC-D3为实验材料,应用KNOCKOUT-DMEM和KNOCKOUT-SERUM REPLACEMENT建立了小鼠ES细胞无血清培养的基础上,结合明胶铺被,初步建立了小鼠ES细胞无血清无饲养层的培养体系,通过比较差速贴壁结合传代和单纯传代对去除饲养层细胞MEF的效果,结果表明,差速贴壁结合传代去除饲养层细胞MEF的效果好于单纯传代,为ES细胞后续诱导分化奠定了基础。同时,mESC-D3细胞通过两阶段单层诱导分化培养共19天,逐渐分化为肝样细胞,光镜和透射电镜对分化细胞形态结构和超微结构的观察表明,分化所得细胞具有肝细胞的形态结构特征。　　 第二部分对ES-D3细胞诱导分化所得的ES-D3-Hep细胞的一些标志基因的表达进行了检测,同时对第一阶段诱导分化过程中诱导分化剂丁酸钠产生的细胞凋亡和细胞周期分布进行了检测。结果表明,分化所得的ES-D3-Hep细胞表达肝细胞具有的标志基因AFP、ALB、TTR和AAT,而自发分化组细胞只是微弱表达AFP和ALB,不表达肝细胞晚期标志物TTR和AAT,提示诱导分化所得的ES-D3-Hep细胞已经具备肝细胞具有的基因表达特征,包含不同成熟阶段的肝细胞。诱导分化7天,NaB引起细胞凋亡使大量细胞的细胞周期阻滞在S期,而通过添加EGF,可以明显降低S期细胞周期的比例,增加G0/G1期细胞的比例,抑制细胞凋亡。　　 第三部分对ES-D3细胞分化所得的ES-D3-Hep细胞进行了相关重要标志蛋白的免疫荧光分析,同时对其肝细胞功能进行了鉴定。结果显示,ES-D3-Hep细胞表达肝细胞特异性标志蛋白ALB、AFP、CK8和CK18,而自发分化组也有一些细胞表达ALB和AFP,但不表达CK8和CK18,诱导分化组肝细胞分化率分别为37.27％和41.67％,两组间差异不显著,和自发分化组比较,差异显著。对ES-D3-Hep细胞进行相关肝细胞特异性功能检测,显示诱导分化组细胞具有代谢ICG的细胞功能,而自发分化组只有少量细胞具有代谢ICG的细胞功能；PAS实验显示ES-D3-Hep细胞具有合成糖原的细胞功能,而自发分化组细胞染色较少且淡染；这些结果表明分化所得的ES-D3-Hep细胞具有肝细胞的特异蛋白分子标记,同时又具备了肝细胞特异的细胞功能。　　 第四部分通过灌胃的方法,通过观察小鼠的行为状态、统计死亡率、病理解剖观察肝脏的病理变化、组织学观察肝脏组织病理变化以及检测血清中的丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)活性的改变,结果表明,5μl/g四氯化碳剂量灌胃的方法,可以建立稳定的小鼠四氯化碳急性肝损伤模型。　　 第五部分利用已经建立的小鼠四氯化碳肝损伤模型,通过脾脏注射的方法,将体外DAPI标记的ES-D3-Hep细胞移植到急性肝损伤小鼠体内,观察是否具有真正的支持肝脏代谢的功能。结果表明,ES-D3-Hep细胞经DAPI标记后,标记率可达到100％,台盼蓝染色检测标记后细胞活率与未标记细胞相比没有明显差别,表明DAPI是一种良好的体外细胞移植示踪标记物；细胞移植后连续10天观察小鼠的存活情况,细胞移植组存活率高于溶剂移植组,但差异不显著；肝脏冰冻切片观察发现,细胞移植可以观察到一些散在的蓝色荧光点,表明移植的ES—D3-Hep细胞可以整合到损伤的肝组织内。　　 第六部分利用建立的小鼠四氯化碳急性肝损伤模型,使用已经建立的正常人胎肝细胞系HL-7702进行腹膜腔移植,观察对急性肝损伤是否具有代谢支撑功能。结果表明,细胞移植组(G1)的血清转氨酶ALT、AST在移植后第3天和第7天相对于空白对照组(G3)显著升高(P<0.05),而相对于溶剂移植对照组(G2)显著降低(P<0.05),而移植后14天,三组差异不显著(P>0.05)。小鼠肝脏白蛋白ALB在移植后的第3天和第14天3组差异不显著(P>0.05),而在移植后的第7天细胞移植组(G1)和空白对照组(G3)差异不显著(P>0.05),但都与溶剂移植组(G2)差异显著(P<0.05)。三组实验动物的组织学观察表明,移植后第3天差异不显著,都表现为严重的组织细胞坏死,而移植后第7天细胞移植组(G1)的损伤程度明显轻于溶剂移植组(G2),到移植后第14天时,存活小鼠肝脏组织学差异不明显,都趋于正常结构,表明细胞移植组的损伤恢复要比溶剂移植组相对要快,尽管细胞移植组(G1)小鼠存活率比溶剂对照组(G2)高,但差异不显著(P>0.05)。结果提示,该永生化胎肝细胞具备正常胎肝细胞的功能,进行腹膜腔细胞移植可以起到明显的改善和缓解作用,其用于生物人工肝的细胞来源具有潜在的价值.