目的人神经系统中尤为重要的转录因子Purα,是体内一个重要的转录因子,不只在神经系统,在体内的许多环节中都有很重要的作用,它与神经元的发育,突触形成都有很密切的关系。本文通过建立Purα基因敲除的小鼠海马神经元细胞系来观察其在DNA损伤修复中的作用。方法1)CRISPR/Cas9基因敲除质粒的构建以及鉴定:依据目的基因靶向去除外显子的位置来设计相对应的sgRNA序列,合成相应的寡核苷酸后克隆在pSpCas9(BB)-2A-Puro(pX459)V2.0质粒载体相对应的位点上,挑选阳性克隆进行酶切和测序鉴定;2)稳定细胞系的建立及鉴定:将克隆好的CRISPR/Cas9-Purα质粒转染到小鼠海马神经元(HT22)细胞中,加入嘌呤霉素进行抗性筛选,保留正常生长的细胞进行培养,运用RT-PCR和Western blot技术分别检测mRNA和蛋白质的表达水平以了解Purα基因的表达情况;3)Purα在DNA损伤修复中的作用:分别用羟基脲(HU)处理细胞,通过Western blot、脉冲电场反转凝胶电泳实验及细胞毒性实验观察Purα在DNA损伤修复中的作用。结果测序的结果证实所插入片段相位正确;利用TA克隆测序和T7E1酶切证实所构建的质粒具有良好的CRISPR/Cas9活性,可以导致基因组碱基发生突变,RT-PCR和Western blot实验结果证实了敲除组的Purα基因表达明显降低。HU致损后,Purα敲除组的细胞DNA损伤更加明显。结论利用CRISPR/Cas9技术将Purα基因敲除后,用嘌呤霉素抗性进行筛选而建立稳定表达的Purα基因敲除的小鼠海马神经元的细胞系,Purα基因敲除后,细胞对HU引起的DNA损伤极为敏感。该细胞系可用作研究Purα基因在神经元中的生物学功能的细胞模型。