人NDRG2(N-myc downstream regulated gene2)基因由本教研室首次克隆出的抑癌基因。NDRG2定位于14号染色体上，编码一个约41kDa的蛋白质。NDRG2属于N-myc下游调节基因家族成员。近年来，我们对NDRG2的生物学功能进行了大量的研究，研究表明其在结肠癌、乳腺癌、甲状腺癌、胶质瘤等多种肿瘤组织中低表达。NDRG2能够促进肿瘤细胞分化、抑制肿瘤细胞的增殖，并且可导致细胞周期阻滞。虽然研究证实NDRG2在诸多肿瘤组织中发挥着抑癌基因的作用，但关于其在某些肿瘤中的作用尚属空白。此外，目前已证实NDRG2受Myc、p53、HIF1、ER、AR等多个转录因子的调控。而通过我们前期生物信息学分析发现53个转录因子可能与NDRG2的启动子区结合，参与其转录调控。因此目前获得的关于NDRG2转录调控信息还远远不能解释其转录调控的复杂性。本课题将利用生物信息学分析的结果拓展NDRG2的转录调控机制的研究，并且在目前尚未报道的小儿高发的神经母细胞瘤中验证NDRG2的生物学功能。我们在前期的研究中通过生物信息学分析发现NDRG2启动子区存在着3个潜在的转录因子KLF4的结合区域。KLF4(Krüppel-like factor4)是一个含有锌指结构的转录因子。研究表明KLF4主要表达于上皮组织，包括胃肠道上皮。其在肿瘤细胞恶性增殖、分细胞化和正常组织稳态维持等多种生理活动中发挥重要作用。KLF4发挥功能主要依赖于其对下游靶基因的转录调控作用，并且具有双重调控作用的特点。近年来的研究表明KLF4通过严密调控结肠上皮细胞的恶性增殖，在结肠癌的生成中发挥着抑癌基因的功能。据此我们推测KLF4可能同样能够对NDRG2发挥转录调控作用。本课题在第一部分对此进行了研究。为了明确KLF4对NDRG2的调控机制，我们首先构建了KLF4真核表达载体，而后克隆了人NDRG2的启动子(-1500bp~+200bp)，并构建了一系列的NDRG2启动子的突变体和截短体，分别克隆至pGL3-basic报告基因载体中。将pGL3-NDRG2载体与KLF4共转染Hela细胞中。荧光素酶报告基因分析显示KLF4可以激活NDRG2启动子的相对活性10倍以上。通过对NDRG2启动子的突变体和截短体进行分析，初步确定KLF4与NDRG2启动子的结合位点。染色质免疫共沉淀(ChIP)及EMSA实验均证实KLF4可以与NDRG2的启动子结合。我们前期的研究结果表明NDRG2能够促进淋巴瘤细胞、结肠癌细胞等的细胞分化，抑制细胞的增殖。提示NDRG2可能在人神经母细胞瘤细胞中发挥同样的作用。若能阐明相关的分子机制则有利于为NDRG2功能的研究提供新的理论依据。本课题在第二部分对NDRG2在神经母细胞瘤细胞的增殖和分化中的作用进行了初步研究。我们先利用全反式维甲酸(ATRA，all-trans retinoid acid)建立神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y和SK-N-SH的诱导分化模型。Western blot检测证实NDRG2在分化的细胞中表达升高。之后，我们利用慢病毒系统建立SH-SY5Y及SK-N-SH过表达或干涉NDRG2的稳转细胞系。可以观察到，与对照相比，NDRG2过表达促进NB细胞的轴突形成；反之，干涉NDRG2则抑制了NB细胞形成轴突的能力。同时我们还发现，在NB细胞分化过程中，NDRG2的细胞定位发生改变，可以自胞浆转位入核。NDRG2细胞定位的改变是否与其促分化功能的发挥有关，还有待进一步的研究。以上结果初步证实NDRG2过表达可以促进神经母细胞瘤细胞的分化，也提示NDRG2在神经母细胞瘤细胞中的低表达可能与肿瘤的发生有关。抑癌基因的甲基化是肿瘤发生的重要机制之一。有文献表明NDRG2在乳腺癌细胞或结肠癌中的低表达是由于基因启动子区的甲基化所致。为了深入探讨NDRG2在神经母细胞瘤中的低表达是否由基因的甲基化所致，我们提取分化NB细胞及对照细胞的基因组DNA，并进行亚硫酸盐处理，设计合成NDRG2甲基化引物，进行PCR扩增及测序。分析NDRG2启动子区16个CpG位点的甲基化状态。测序结果表明，诱导分化的细胞中NDRG2启动子甲基化程度明显低于对照组细胞。用甲基化酶抑制剂5-aza处理肿瘤细胞后，Western检测NDRG2的表达水平比对照细胞明显增高。这初步提示NDRG2启动子甲基化是其在神经母细胞瘤细胞中的低表达的重要原因。我们进一步检测NDRG2对神经母细胞瘤细胞的增殖和迁移的影响。MTT实验、EdU标记实验、平板克隆形成实验及划痕实验结果表明，与对照相比， NDRG2过表达的肿瘤细胞增殖和迁移能力明显受到抑制。同时我们用流式细胞术检测了细胞周期，结果表明过表达NDRG2后，细胞周期阻滞于G1/S期，细胞周期相关分子CDK2, CyclinE1的表达下调, p21和p27的表达上调。在以往的研究中我们利用酵母双杂交的方法筛选到一个能够与NDRG2相互作用的蛋白质MSP58(58-kD amicrospherule protein)，并验证了两个分子之间的相互作用。从而MSP58成为阐明NDRG2基因功能的新线索。目前的研究结果表明：MSP58与细胞周期密切相关，并且其表达程度与细胞的增殖能力呈正相关，是一个促进细胞恶性增殖的癌基因。课题的第三部分我们针对MSP58在神经母细胞瘤的表达及其在神经母细胞瘤增殖中的作用进行了探索。结果表明MSP58在人神经母细胞瘤组织与细胞系中高表达。之后选取SH-SY5Y细胞作为研究对象，将针对MSP58的三种干涉载体及对照PLKO-scramble分别包装成慢病毒后感染SH-SY5Y细胞，经过puromycin筛选后建立稳转细胞系。研究结果表明，与对照相比，干涉MSP58后肿瘤细胞的增殖和迁移能力明显受到抑制。增殖相关基因如Ki-67和E2F1的表达下调。同时细胞周期阻滞于S期，细胞周期相关分子CDK2和CyclinA的表达下调。综上所述，本课题研究了NDRG2转录调控机制，并对其在人神经母细胞瘤增殖和分化中的作用进行了初步探讨。研究结果证实了转录因子KLF4对NDRG2的转录调控作用；明确了NDRG2具有促进NB细胞分化，抑制其增殖的作用，并对抑癌基因NDRG2在神经母细胞瘤中的低表达的机制进行了初步的探讨。同时，我们也对NDRG2相互作用分子MSP58在神经母细胞瘤中的作用进行了研究，证实了MSP58在神经母细胞瘤中同样发挥着癌基因的作用。研究结果是对NDRG2转录调控机制的重要补充，同时也为临床小儿神经母细胞瘤的诊断和治疗提供了新的潜在靶点。