研究背景和目的结直肠癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤,居胃肠道肿瘤的第二位。近二十年来,随着我国人民饮食结构的改变,结直肠癌的发病率呈逐年上升的趋势,严重危害人类的健康。和其他肿瘤一样,其病因迄今尚未明确。因此探讨与结直肠癌致病相关的因素,阐明结直肠癌发病机制,寻找预防和治疗的有效途径,是当前研究的重要方向。核基质结合结合因子(Scaffold attachment factor B,SAFB)是一种多功能蛋白,位于19号染色体19p13.3。它属于一个核蛋白家族,定位于核基质中,通过与核基质中DNA和RNA相互作用,影响RNA转录后加工,参与发育、组织重建、细胞应激反应以及细胞增殖和凋亡过程。目前有研究表明SAFB与乳腺癌发生和预后关系密切,尽管SAFB在乳腺癌中的作用较明确,但在其它肿瘤中未见报道,其在结直肠癌发生、发展及转移中的作用及分子机制亦尚未阐明。因此,本研究重点探讨SAFB基因在结直肠癌增殖、侵袭及转移过程中的可能作用及分子机制,旨在阐明SAFB在结直肠癌发生发展中的主要生物学功能,为结直肠癌的早期诊断、干预和治疗及其预后奠定理论基础。方法1.结直肠癌组织及结直肠癌细胞株中SAFB的表达及临床意义运用RT-PCR、Real-time PCR及Western blot方法检测SAFB基因在8种结直肠癌细胞株及28对配对结直肠癌和正常组织中的mRNA和蛋白表达；应用免疫组化S-P法,检测283例结直肠癌组织和配对的114例正常结直肠组织以及120例结直肠癌区域淋巴结转移癌蛋白的表达。2.SAFB过表达载体构建及对结直肠癌细胞生物学特性的影响运用RT-PCR法扩增目的基因SAFB,与空载体pcDNA3.1(-)连接后,在8种结直肠癌细胞株中低表达的细胞株SW480中导入pcDNA3.1(-)/SAFB, Real-timePCR及Western blot鉴定转染后SAFB基因在细胞中的表达；观察SAFB基因转染前后,细胞增殖的变化。3.SAFB干扰载体的构建及表达沉默对结直肠癌细胞生物学特性的影响设计SAFB干扰片段,将人SAFB基因RNA干扰双链DNA片段重组到逆转录病毒质粒pSUPER Retro中,构建携带人SAFB基因RNA干扰的逆转录病毒载体pSUPER/shRNA-SAFB,经293FT病毒包装细胞后,产生重组逆转录病毒,感染结直肠癌细胞株,经puromycin筛选稳定的细胞克隆,实时荧光定量PCR和Western blot法检测细胞中SAFB基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平。用含SAFB的特异性干扰片段的逆转录病毒感染结直肠癌细胞,用含空载体的病毒做对照。用6418筛选抗性克隆,挑取抗性单克隆,荧光定量PCR和Westernblot鉴定干扰后SAFB基因在细胞中的表达；利用MTT法、平板克隆形成实验检测SAFB对细胞体外增殖的影响。4.SAFB表达异常引起结直肠细胞生物学功能异常的分子机制通过Real-time PCR及Western blot方法检测结直肠癌细胞转染pcDNA3.1(-)/SAFB及SUPER/shRNA-SAFB后, E-Cadherin、Slug、Snai1、MTA、α-cantenin、γ-cantenin、β-cantenin、AKT、P38 MAPK、GSK、p-AKT、p-P38 MAPK、p-GSK等的mRNA和蛋白表达水平的变化。结果1.结直肠癌组织中SAFB蛋白的表达应用RT-PCR检测8种结直肠癌细胞株SAFB基因的表达,结果表明SAFB基因在SW620细胞中表达较高,在DLD-1、SW480-M5、LS174T和HT29中度表达,在SW480、HCT116、colo205表达较低。应用RT-PCR、Real-time PCR及Western blot检测28对结直肠癌配对组织SAFB在mRNA和蛋白水平的表达,结果表明28对结直肠癌配对组织中SAFB基因在肿瘤组织表达较高,在正常结直肠组织表达较低或不表达,而其表达水平高低与结直肠癌浸润程度、分化程度及转移无明显相关性。免疫组化结果显示SAFB在正常结直肠黏膜、癌、远处转移癌和淋巴结转移癌四种类型的组织中表达明显不同,差异具有显著性(x2=271.214,P<0.01)。两两比较发现,在正常黏膜组织和肿瘤组织中,SAFB蛋白的表达前者显著低于后者(Z=-4.608,P=0.000),发生远处转移癌组织和淋巴结转移癌组织SAFB表达与配对的结直肠原发癌组织无显著性差异(Z=-0.156,P=0.876；Z=-0.466,P=0.642)。本研究结果提示,SAFB蛋白表达与结直肠癌发病及肿瘤细胞增殖高度相关,即SAFB表达弱或阴性者结直肠发生率低,表达强者发生率高,而与结直肠癌的转移无明显相关性。2.过表达SAFB真核表达载体的构建及转染SAFB过表达对结直肠癌细胞生物学特性的影响设计人SAFB特异性引物,提取人正常结直肠上皮组织总RNA,应用RTPCR方法提取人SAFB cDNA,通过双酶切,将SAFB克隆至pcDNA3.1(-)质粒,经双酶切及测序鉴定,确定构建人SAFB基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)/SAFB,转染SW480细胞,用Western Blot技术检测目的蛋白的表达。通过MTT法,我们检测了SAFB对结直肠癌细胞体外增殖能力的影响,与pcDNA3.1(-)/vector细胞相比,pcDNA3.1(-)／SAFB细胞的增殖能力增强,差异具有统计学意义(F=71.944,P<0.01)。3.通过RNAi技术建立SAFB基因稳定沉默的结直肠癌细胞株及对结直肠癌细胞生物学特性的影响构建了2个SAFB的逆转录病毒干扰载体pSUPER/shRNA-SAFB1、pSUPER/shRNA-SAFB2(简称S1和S2)及空载体病毒pSUPER retro neo(简称PRS),感染HCT116、SW480及SW620细胞,筛选出G418抗性单克隆,荧光定量PCR和Western blot结果发现含两种片段干扰载体的干扰效率均较高,以S2为甚,且对SW620细胞的干扰效率最好,命名为SW620/pSUPER/shRNA-SAFB。MTT法观察SAFB基因表达沉默后体外细胞的增殖情况,与SW620/pSUPER细胞相比,SW620/pSUPER/shRNA-SAFB细胞的增殖速度减慢显著,并且呈时间依赖关系(F=3.361,P<0.01)。平板克隆形成实验显示SW620/pSUPER/shRNA-SAFB细胞的活力显著下降,差异具有统计学意义(F=267.579,P=0.000)。这些结果均说明SAFB表达水平减低后,结直肠癌细胞体外生长被显著抑制。4.SAFB表达异常引起结直肠细胞生物学功能异常的分子机制1)SAFB对相关钙粘附蛋白的影响及其与上皮间叶转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)发生的关系Western blot显示,SAFB可以诱导钙粘附蛋白(E-cadherin)表达缺失。SW480细胞自身E-cadherin的表达缺如或者检测不到,但当SAFB表达水平被抑制时,SW480细胞E-cadherin则恢复表达。Slug、Snail、MTA是参与上皮间叶转化的重要转录因子,Western blot结果显示,在SAFB敲低的两个克隆中,Slug、Snail、MTA的表达受到抑制；Snail、MTA和Slug与E-cadherin的表达成负相关关系,这与SAFB对二者的调节也是一致的。2)SAFB对Catenin家族成员的影响Western Blot检测表明,抑制SAFB基因表达对catenin家族的影响不明显。3)GSK-3β磷酸化是SAFB调节钙粘附蛋白相关信号通路的重要方式我们观察到,抑制SAFB表达使GSK-3β磷酸化明显受抑制,p-GSK-3β表达下调,GSK-3β表达无明显改变。4)SAFB对P38 MAPK相关信号通路的影响我们观察到,SAFB敲低P38 MAPK磷酸化明显受抑制,p-P38 MAPK表达下调,P38 MAPK表达无明显改变。5)SAFB对AKT相关信号通路的影响Western Blot检测表明,SAFB基因沉默对AKT信号通路的影响不明显。结论1、SAFB基因与结直肠癌细胞增殖密切相关,提示SAFB基因可能参与结直肠癌的发生及发展；2、SAFB可能参与+它在结直肠癌中的作用,证实SAFB通过诱导E-cadherin表达下调促进结直肠癌细胞上皮间叶转化；3、SAFB可能通过激活MAPK信号通路,磷酸化GSK-3β,激活下游的细胞增殖调节基因(CyclinDl等),从而促进细胞增殖及转移；调节EMT分子标志物的表达,可能促进结直肠癌的转移。本研究的创新之处：1、构建了SAFB过表达和敲低的相关载体,建立了SAFB过表达和敲低的结直肠癌细胞克隆；2、发现SAFB参与结直肠癌细胞钙粘附蛋白相关信号通路的调节,证实SAFB通过诱导E-cadherin表达下调促进结直肠癌细胞上皮间叶转化；3、SAFB促进细胞内GSK-3β及P38 MAPK磷酸化参与钙粘附蛋白相关信号通路的调节。