论文部分内容阅读
目的:为深入研究慢性氟中毒神经损伤的发病机制,本实验在前期氟中毒研究的基础上选用体外培养人脑神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞)株,并复制氟中毒细胞模型,通过加入和不加入神经型一氧化氮合成酶(Neuronal nitric oxide synthase,nNOS)抑制剂7-硝基吲唑(7-nitroindazole,7-NI),研究氟对培养SH-SY5Y细胞细胞增殖、NO/NOS的变化及7-NI对氟中毒性SH-SY5Y细胞细胞增殖、NO/NOS的影响。方法:(1)SH-SY5Y细胞增殖活性检测:采用细胞增殖与活性检测试剂盒(cell counting kit 8,CCK-8)筛选出体外培养SH-SY5Y细胞时氟化钠(Sodium fluoride solution,NaF)和7-NI的最佳药效浓度。(2)实验分组及处理:实验分为对照组、染氟组、抑制剂染氟组。对照组:细胞不做任何处理。染氟组:只加NaF处理细胞,不做其他任何处理;NaF浓度为0mmol/L、0.2mmol/L、2.0mmol/L,处理时间为48h。抑制剂染氟组:NaF+7-NI处理细胞,NaF浓度为0mmol/L、0.2mmol/L、2.0mmol/L,在不同浓度NaF处理的细胞中各加入1μmol/L 7-NI,处理时间为48h。(3)倒置显微镜观察各组细胞形态,透射电镜观察细胞超微结构;硝酸还原酶法和比色法检测各组细胞培养液中一氧化氮(nitric oxide,NO)含量和一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase,NOS)活性;实时荧光定量PCR(Real-time PCR)方法检测各组nNOS mRNA水平;蛋白免疫印迹(Western Blotting)法检测各组细胞nNOS蛋白表达情况;流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。结果:(1)染氟(0.2mmol/L、2.0mmol/L NaF)组细胞增殖率低于对照组,高氟组低于低氟组,差异有统计学意义(P<0.05);与染氟组比较,染氟和7-NI共培养组细胞增殖率明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),无氟7-NI组与对照组比较无差异(P>0.05)。(2)普通倒置显微镜镜下观察,染氟组细胞生长密度逐渐降低,低氟组部分细胞开始皱缩、变圆,胞浆中可见颗粒样变化,随着染氟浓度增加高氟组大多数细胞出现皱缩、变圆,部分核固缩,细胞间隙增大,呈网状,可见小部分细胞脱落。染氟与7-NI共培养细胞后,细胞生长密度逐渐增加,大部分细胞形态变为梭形,仅少数呈圆形、不规则形。(3)透射电镜下观察,染氟后可见细胞皱缩,核染色质固缩,浓染,染色质部分边集;细胞质中细胞器数量明显减少,部分线粒体排列紊乱,线粒体嵴断裂、缺失,并出现不同程度的空泡化,内质网扩张。染氟与7-NI共培养细胞后,细胞膜和核膜较完整,核仁明显,但仍可见部分核染色质固缩,浓染;胞质中细胞器数量较染氟组明显增多,高尔基体、内质网等细胞器未见明显异常,线粒体空泡化较染氟组减少。(4)染氟组NO含量、NOS酶活性、nNOS mRNA和蛋白相对表达水平均较对照组增高(P<0.05),且高氟组高于低氟组(P<0.05);染氟与7-NI共培养组上述各指标与染氟组比较表达明显减弱(P<0.05)。(5)染氟组细胞凋亡率较对照组增高,且高氟组高于低氟组,差异有统计学意义(P<0.05);染氟与7-NI共培养细胞后,细胞凋亡较染氟组降低(P<0.05);无氟7-NI组与对照组比较无差异(P>0.05)。结论:(1)过量氟暴露能抑制SH-SY5Y细胞增殖和促进细胞凋亡发生,并使SH-SY5Y细胞形态和超微结构发生改变,这些细胞损伤可能与氟对NO含量、NOS活性增高、nNOS表达的影响有关。(2)7-NI对氟致nNOS上调有一定抑制作用,在体外可抑制氟中毒引起的SH-SY5Y细胞损伤作用,这为氟中毒所致神经系统损伤治疗药物的研究提供了实验基础。