全球生物多样性锐减是21世纪最严重的环境危机之一,严重影响着地球的生态服务功能和人类的可持续发展。两栖动物被认为是地球上受威胁程度最大的脊椎动物,作为淡水和陆地生态系统中物质循环和能量流动的重要承担者,其种类、数量和生存现状,不仅影响生态系统的结构和功能,还深刻反映生态系统的健康状况,对自然因素和人类活动干扰下的生态环境质量有重要的指示意义。当前,加强两栖动物多样性监测,有效评估物种分布与受威胁程度是物种保护的关键。然而传统的两栖动物监测方法主要依靠形态学鉴定或声音识别,对研究人员的专业知识与鉴定经验要求很高,监测过程耗时费力且具有一定的侵入性,高通量测序技术的不断发展,使得环境DNA有望成为下一代水生生物监测的有效工具。然而在技术应用的过程中,各个国家和地区的研究方法各不相同,我国在环境DNA生物监测方面的研究刚刚起步,适合本土的条形码数据库、通用扩增引物和监测体系的缺乏是该方法得以应用的重大瓶颈问题。本研究旨在建立一套适用于我国两栖动物的环境DNA宏条形码监测方法。研究首先整理了现存中国两栖类物种名单,通过测序和数据下载,构建了用于我国两栖动物环境DNA高通量测序信息注释的条形码数据库;其次,通过比对现生中国两栖动物线粒体基因序列,设计并筛选出了适用于本土的两栖动物宏条形码监测引物;然后,结合前两章研究成果,探索形成从采样-实验室处理-数据分析的一整套两栖动物多样性监测的技术流程,通过微宇宙实验验证了该方法的可靠性和灵敏性,并对南京周边的三个森林保护区开展了两栖动物宏条形码监测。本论文的主要研究内容及结论如下:（1）构建了我国两栖动物物种条形码数据库。通过分析现生中国两栖类分子遗传进化特征,确定了线粒体12S-16S基因作为适合两栖动物多样性鉴定的条形码区域,并以此构建了一个包含近470个物种的中国两栖动物公共条形码数据库和一个包含30个物种的本土两栖动物条形码数据库,覆盖了国内近84%的物种,有助于国内两栖动物监测数据的准确注释。（2）筛选了适合我国两栖动物宏条形码监测引物。研究发现,线粒体16S基因Am250引物最适合本土两栖动物的多样性监测,该引物实现了本土测试物种100%的物种检出率;12S基因更有利于鱼螈科和隐鳃鲵科等稀有物种的检出,多对引物联合使用可以提高对两栖动物群落的扩增能力与低丰度物种的检测能力。（3）建立了一套两栖动物宏条形码监测技术方法。微宇宙实验成功扩增出了水池中投放的所有两栖动物,并在投放和去除物种的时间节点处都显示出明显的物种丰度变化,体现了所开发方法的可靠性和灵敏性。该方法应用于南京周边的三个森林保护区并成功检出14种两栖动物,覆盖了历史记录中2/3以上的物种,大大降低了物种监测中的人力与时间成本,为推进两栖动物监测的高效化、规范化提供技术支撑。本研究主要解决了环境DNA技术应用于两栖动物监测时采样方案设计、DNA扩增、数据库注释等难点问题,构建的监测方法将有助于两栖动物环境DNA宏条形码监测方案的调查设计,为形成科学、完善、高效的两栖动物多样性监测体系提供案例借鉴和技术参考。