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猪囊尾蚴病（Cysticercosis cellulosae）是由猪带绦虫（Taenia solium）的幼虫猪囊尾蚴（Cysticercus cellulose）所引起的一种人畜共患病。该病广泛存在于发展中国家，不仅严重影响养猪业的发展，造成巨大的经济损失，而且还威胁着人类身体健康。因此，1993年世界卫生组织将猪囊尾蚴病列为需要根除的六大疾病之一。目前，囊虫病的防治以疫苗免疫和药物治疗为主，但普遍存在疫苗保护力不够、药物的毒副作用太大等缺点，所以新型疫苗和药物的研制一直是人们关注的焦点。dUTP焦磷酸酶（dUTPase）是一种重要的DNA复制修饰酶，广泛存在于各种生物有机体中，可特异性水解dUTP产生dUMP和PPi，防止DNA复制过程中dUTP浓度过高而引起的错误掺入，提高了DNA复制的精确性。近年来dUTPase作为一种新的药物靶蛋白越来越受到人们的重视，许多病毒、细菌和寄生虫的dUTPase晶体结构被解析，研究dUTPase在抗囊尾蚴病中的作用，为dUTPase的药物设计和开发提供了有力的支持。本实验首次成功克隆出猪囊尾蚴dUTPase（Cysticercus cellulose dUTPase，CY dUTPase）基因，测序结果显示与已知的猪带绦虫六钩蚴dUTPase基因的核苷酸同源性为100％。为进一步研究CY dUTPase的生物学功能，将其与pET28载体连接后在大肠杆菌BL21（DE3）中进行了大量表达，表达产物主要以可溶性形式存在。同时将pET28空载体进行相同的表达纯化对照实验，重组表达菌液的超声上清经镍琼脂糖凝胶纯化后进行SDS-PAGE检测，结果只是在重组猪囊尾蚴dUTPase菌液上清中出现21KD大小的特异性条带，这说明本实验表达纯化的CY dUTPase中完全排除了宿主dUTPase的污染。dUTPase催化底物（dUTP）生成dUMP和焦磷酸（PPi），PPi与钼酸铵形成的复合物在575nm有特定的光吸收值，测定575nm的OD值就能计算出PPi的量。在CY dUTPase的催化反应中，通过测定产物PPi单位时间的生成量来计算底物的消耗量，以此计算酶的催化活力。结果显示重组dUTPase每分钟水解1nmol dUTP所需的酶量为21.3095μg，纯化的dUTPase 1个酶活力单位为21.3095μg；酶的比活力为46.929U／mg。在酶促反应体系中加入不同金属离子或EDTA后测定dUTPase活力的变化，结果EDTA可以抑制CY dUTPase的活性；而金属离子可以增强酶的活性。同时金属离子还可以恢复被EDTA抑制的dUTPase的活性，其中以Zn2+的恢复效果最明显，可以使dUTPase的活性恢复99.65％。在所测定的四种金属离子中，Mg2+对dUTPase活性的增强作用最明显。为进一步研究CY dUTPase结构和功能的关系，用SWISS-MODEL直接构建了CY dUTPase的3D模型，通过WHAT IF、ProSac程序对模型进行立体化学结构、能量分布的质量评估，模型评估的得分结果表明所建模型结构合理。CASTp程序的口袋分析显示CY dUTPase共有27个活性口袋，其中第26号口袋主要由CY dUTPase的β-发夹构成，该发夹结构是大多数已知晶体结构的三聚体dUTPase活性口袋的重要组成部分，表明CY dUTPase可能与其它三聚体dUTPase具有同样的催化机制。CY dUTPase C端的Gly富集区（Gly-X-Gly-X-X-Gly），Ala（83）和Tyr（90）等这些关键氨基酸与其它三聚体dUTPase（Human dUTPase）高度保守，这些氨基酸不仅能维持口袋区正常的空间结构，同时也在酶与底物的识别中起决定性作用。通过对不同类型dUTPase晶体结构的分析，推测CY dUTPase属于同源三聚体。用SymmDock程序预测了CY dUTPase的四级结构，该结构显示CY dUTPase的活性区是由3个亚基各自的β-发夹、α-螺旋和C端环肽链共同组成，这与大多数三聚体dUTPase的催化活性区结构相一致。将CY dUTPase的四级结构与已知三聚体dUTPase的晶体结构进行叠合，结果显示两者能很好的吻合，证明构建的CY dUTPase四级结构合理。成功构建的CY dUTPase 3D模型为抗囊虫药物的设计和开发提供了一个良好的研究模型。通过在线服务器设计CY dUTPase的siRNA靶位点，针对靶序列设计shDNA（short hairpin DNA）时，在其3’端引入一段与鼠U6启动子3’端同源互补序列，5’端则加入一段下游通用引物，设计好的shDNA由IDT公司合成。从鼠的肌肉中提取基因组并扩增出U6启动子序列，将U6启动子和shDNA一起退火延伸，分别用U6启动子的上游引物和shDNA的下游引物进行PCR，采用重叠延伸一步法制备CY dUTPase的siRNA表达盒（siRNA expression cassettes，SECs）。选取猪囊尾蚴肌动蛋白基因（clone pAT5 actin）作为内参照，建立了CYdUTPase基因半定量RT-PCR的检测方法。CY dUTPase干涉表盒的制备和半定量RT-PCR的检测方法的建立，为CY dUTPase基因RNAi的研究奠定了基础，同时也为囊虫病反义药物的研制提供了理论依据。