水稻抗白叶枯病候选基因—Xa4的克隆研究

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分离和克隆抗病基因并对其加以利用是研究植物—病原物互作的最终目标。目前随着植物抗病研究的深入,已经克隆了许多抗病基因。由于目前所克隆的R基因有很多都具有NBS-LRR的结构,因此许多研究都集中在具有该类结构的基因上。这些基因的产物在序列和结构上都有许多共同特征,如编码的蛋白含有C末端的富亮氨酸重复单位(LRR)和N末端的核苷酸结合位点(NBS),NBS一般都具有如下的保守氨基酸序列:GMGGIGKTTL、LIVLDDVW、SRIIVTTR、GLPLA等。因此可以利用NBS的保守序列,设计简并引物在不同的植物的基因组去发掘新的NBS-LRR类抗病基因。 众所周知,水稻白叶枯病是世界水稻3大病害之一。目前已经定位了20多个抗白叶枯病基因,并且已经克隆到两个抗白叶枯病基因Xa21和Xa1。由于植物抗病性与病原菌的致病性是相互进化的,所以克隆和研究新的抗白叶枯病基因是水稻抗病研究的客观要求。另外,随着基因组测序的进展,目前关于基因组的研究已经成为分子遗传学研究不可缺少的内容。本研究利用与白叶枯病抗病基因Xa4共分离的标记RS13,从BAC文库中筛选到Xa4的候选BAC克隆,并对这些克隆进行了序列测定和分析,主要结果如下: 1、将Xa4定位于标记56M22F和26D24R之间,分别距两个标记0.4和0.7cM,物理距离约为90kb,并且同抗病相关序列RS13共分离。 2、利用RS13从IR64的BAC文库中筛选到4个克隆,其中1个克隆14E19覆盖其余3个克隆,14E19可能含Xa4候选基因。从IRBB56的BAC文库中筛选到12个克隆,利用它们构建了覆盖物理距离约420kb的跨叠克隆群,其中106P13可能含Xa4候选基因。 3、对14E19进行了鸟枪法全序列测定,成功获得了14E19的序列完成图。对这些序列分析发现,其上有4个高度同源的NBS-LRR序列,我们将其定名为Xa4A—Xa4D。另外,在这个BAC序列上还发现一些具有其它特征的序列,这些序列是基因组的组成特征,并且与基因的存在与否有相。 4、比较发现Xa4B具有较长的LRR序列,可能具完整的Xa4基因的功能。构建了Xa4B的农杆菌转化载体,已经转移到水稻台北309中。mRNA分析也表明Xa4B极有可能为Xa4基因。6、进一步对IRBB56的BAC克隆106P13进行部分序列分析,发现其上有12个与Xa4B高度同源的拷贝。7、在106P13上发现一个重复单位为90bP的重复序列,该序列广泛存在于水稻基因组中,PcR扩增和序列数据库搜索发现该序列是水稻特有的重复序列。
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