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规律成簇的短回文重复序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）是原核生物基因组中的重复序列,是在细菌生命进化过程中与病毒相互对抗时出现的一种免疫系统,运用此系统,细菌能够从它们的染色体上切除病毒基因。近年来研究人员将CRISPR系统开发作为基因编辑工具已成功应用于小鼠、人类细胞、烟草和微生物等多种模式生物中。家蚕作为一种重要的模式生物,家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV）是蚕业上的主要蚕病之一,严重制约着蚕桑产业的发展。而随着对CRISPR系统的深入探究发现CRISPR家族的新成员Cpf1,它同时具有DNA酶和RNA酶活性,使得Cpf1编辑系统在结构和作用机理上存在着更多的优势。因此,迫切需要在家蚕模式生物中建立Cpf1编辑系统,利用其优势高效地作用于BmNPV基因组,提高家蚕抗病毒能力。本研究首先构建家蚕AsCpf1、FnCpf1和LbCpf1编辑系统,检测其编辑能力;进而构建靶标BmNPV ie1的敲除载体,分析敲除BmNPV ie1基因后对病毒增殖复制的影响并检测其敲除效率;综合以上结果筛选出最优FnCpf1,分析FnCpf1和SpCas9分别对BmNPV的抑制效果;利用FnCpf1同时靶标BmNPV多个位点,构建靶标BmNPV ie1基因的多位点gie1234敲除系统和靶标BmNPV多个基因g13467的敲除系统,分析敲除系统对靶位点的敲除,并对FnCpf1敲除多个靶位点后的基因敲除效率分析。论文取得的主要结果如下:1.家蚕CRISPR/Cpf1编辑系统的建立根据CRISPR/Cpf1编辑系统的原理,设计并成功构建CRISPR/Cpf1和gRNA（hsp60和atad3a基因）敲除载体,发现Cpf1蛋白在细胞核内表达,可以用于基因编辑检测。敲除载体转染细胞48 h后提取基因组,利用T7E1酶切法和克隆测序分析CRISPR/Cpf1系统对靶基因的敲除效果,发现靶标基因存在碱基敲除和大片段插入。进一步通过Western Boltting检测CRISPR/Cpf1系统敲除靶标基因后对其蛋白表达水平影响,发现AsCpf1、FnCpf1和LbCpf1对不同的靶基因都有敲除效果,导致其蛋白表达量下调。2.CRISPR/Cpf1系统在单基因编辑系统中的应用进一步检测CRISPR/Cpf1对病毒的抑制作用,构建敲除BmNPV ie1的表达载体,测序发现ie1病毒基因出现单碱基缺失和大片段敲除现象。而后敲除载体转染细胞48 h后感染BmNPVHSP-EGFP绿光示踪病毒,荧光显微镜观察病毒感染后0、12、24和48 h荧光细胞数并统计荧光细胞占比,发现在感染病毒24 h时MOCK、AsCpf1、FnCpf1和LbCpf1的荧光细胞数比例是25.6%、13.2%、10.8%和13.2%;在感染病毒48 h时MOCK、AsCpf1、FnCpf1和LbCpf1的荧光细胞数比例是56.6%、30.7%、24.1%和27.8%;在病毒感染的24和48 h均能观察到荧光数目明显减少。利用流式细胞术分析感染病毒后EGFP阳性细胞增殖情况,在病毒感染后的24 h观察到MOCK、AsCpf1、FnCpf1和LbCpf1的EGFP阳性细胞占比分别是19%、15%、10%和15%;病毒感染48 h观察到MOCK、AsCpf1、FnCpf1和LbCpf1的EGFP阳性细胞分别是57%、47%、43%和44%,得知AsCpf1、FnCpf1和LbCpf1均有不同程度的敲除ie1基因,导致EGFP细胞增殖减少。进而通过qRT-PCR和Western Boltting检测病毒感染48 h后,AsCpf1、FnCpf1和LbCpf1敲除BmNPV ie1后对病毒拷贝数和病毒蛋白表达影响,发现ie1基因的转录和翻译水平都明显受到抑制。综合以上结果发现AsCpf1、FnCpf1和LbCpf1编辑系统都能够有效敲除BmNPV ie1,其中抑制病毒增殖最明显的是FnCpf1。利用qRT-PCR和Western Boltting检测SpCas9和FnCpf1敲除系统对BmNPV ie1基因的编辑,发现两种敲除系统都能够敲除外源基因,而且FnCpf1敲除效果优于SpCas9。3.CRISPR/Cpf1系统在多基因编辑系统中的应用为了检测FnCpf1编辑系统靶标多个位点的基因编辑效率,构建了敲除BmNPV ie1的360 bp、597 bp、927 bp和1200 bp多个位点处的gie1234表达载体和敲除BmNPV的lef1、lef3、p143、gp64、p74和ie1多个基因的g13467表达载体。敲除载体转染细胞48 h后,荧光显微镜分别观察感染BmNPVHSP-EGFP示踪病毒的0、12、24和48 h后荧光细胞数目变化,发现在感染后的24和48 h,相比于MOCK的荧光细胞数,FnCpf1系统的gie1、gie1234和g13467荧光细胞数明显减少,而相比于单靶标gie1,两个多位点敲除系统的荧光明显变少。在感染病毒48 h时分析病毒和敲除载体共定位情况。进一步利用测序检测靶位点的敲除情况,发现gie1234和g13467系统都可以编辑BmNPV基因组。通过荧光定量PCR和Western Boltting检测FnCpf1敲除多靶位点后病毒拷贝数和病毒蛋白变化,发现感染病毒48 h后,FnCpf1能够有效敲除病毒基因,导致gp41和病毒蛋白VP39的表达均有下调;相比于单靶标gie1,两个多位点敲除系统明显更少。TCID50分析计算FnCpf1敲除病毒基因的病毒滴度,FnCpf1敲除系统的TCID50相比MOCK对照组降低一个数量级。研究结果表明,成功构建了家蚕CRISPR/Cpf1基因编辑技术体系,并且多基因编辑系统更有效的敲除BmNPV基因组。该系统不但为家蚕抗病育种提供了新方向,也为生物体的基因功能鉴定奠定了很好的技术平台。