3α-羟类固醇脱氢酶(3α-Hydroxysteroid Dehydrogenase,3α-HSD)是睾酮假单胞菌产生的一种类固醇脱氢酶,可作用于多种类固醇基质,可逆地催化C19-27类固醇3位羟基/酮基的氧化还原。胆汁酸是3α-HSD的作用底物之一,(?)3α-HSD在临床上主要用作工具酶来测定人血清中的总胆汁酸(Total Bile Acids, TBA)浓度,以检测肝功能。目前,TBA测定中所用的工具酶3α-HSD多从睾酮假单胞菌中直接提取而来,提取工艺复杂,步骤繁琐,这使得直接分离的天然3α-HSD价格昂贵,在一定程度上限制了该酶在临床检验中的推广通过PCR扩增和重组质粒构建我们构建了HSD的表达克隆pThioHisA-HSD,通过菌种的单克隆筛选初步筛选了表达量较高的菌种。对不同诱导时间表达的蛋白量进行比较,发现当诱导表达时间达到6h后目的蛋白表达量最高。目的蛋白表达量随诱导物IPTG的浓度增加而增高,当IPTG浓度达到1.0mM后目的蛋白表达量变化不再明显,因此1.0mM是合适的诱导物浓度。当诱导温度是37℃时,目的蛋白表达量比在25℃和30℃下要高。因此确定了HSD的诱导表达条件,即在37℃,1.0mM IPTG(异丙基-β-D-硫代毗喃半乳糖苷)诱导表达6h。当硫酸铵浓度为50-60%时大部分目的蛋白被沉淀下来,而大部分杂质蛋白被去除,通过比较分子筛与离子交换层析纯化效果,两种方法都能有效地纯化目的蛋白,但是离子交换层析回收率更高,更经济有效。最后进一步优化了目的酶蛋白的保存温度,保存液成分、pH值等条件,发现3α-HSD在25℃以下、pH7.4时保存比较稳定文中方法经济简便,重复性好,制备的3α-HSD纯度较高,且目的酶蛋白在优化过的保存条件下可以长期保存。本研究对降低肝功能检测的成本以及诊断成本,有着深远的意义。