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【目的】
探讨对威罗菲尼(vemurafenib)耐药的黑色素瘤细胞，其药物成瘾程度与药物耐受剂量之间的关系，并探究介导二者间相关性的分子和生物学机制。
【方法】
1.耐药黑色素瘤细胞：通过连续在黑色素瘤M14细胞生长液中添加0.5μmol/L或2μmol/L威罗菲尼，建立耐药细胞株M14/R0.5和M14/R2.0。另外实验室前期保存有对威罗菲尼耐药的黑色素瘤细胞株A375/R0.5和A375/R2.0。以相应的敏感细胞A375和M14为阴性对照。
2.克隆形成实验：将黑色素瘤细胞种于12孔板中，添加或不添加相应浓度的威罗菲尼，每周更换两次培养基，当克隆形成明显时，用结晶紫染色。拍照后，用33%醋酸溶液溶解结晶紫，用酶标仪在590nm处检测吸光度。以观察两种耐药细胞是否对威罗菲尼产生成瘾性。
3.Westernblot实验：通过Westernblot实验分析撤除威罗菲尼后，对黑色素瘤耐药株ERK1/2-FRA-1通路的影响。
4.上清液收集及克隆形成实验：在A375/R0.5和A375/R2.0培养过程中收集威罗菲尼撤药4天后的细胞上清液，将收集到的上清液分别添加到对应细胞的培养液中，观察耐药细胞分泌的细胞因子是否介导药物成瘾性。
5.衰老染色实验：通过对耐药细胞撤除或不撤威罗菲尼培养4天后，做衰老染色检测。用PBS清洗细胞并在室温下固定15分钟，用PBS洗涤细胞后，在37℃下用衰老染色染液孵育过夜，并用显微镜拍照。
6.细胞增殖实验：通过对耐药细胞撤除威罗菲尼或不撤药培养，4天后做EdU检测。细胞在37℃用EdU处理4h，用4%多聚甲醛固定后，用PBS冲洗，将100μL的1×Apollo?反应液加入孵育30min，然后用Hoechst33342染细胞核。使用荧光显微镜拍摄图像，并用ImageProPlus6.0软件评测EdU的整合率。
【结果】
1.成功构建了对威罗菲尼耐药的黑色素瘤株M14/R0.5和M14/R2.0。M14/R0.5以及M14/R2.0细胞状态良好，在含有威罗菲尼的生长液中生长速度快。
2.耐药M14细胞对威罗菲尼具有成瘾性。
克隆形成实验显示，在M14/R0.5和M14/R2.0细胞的培养过程中，撤除威罗菲尼后，细胞的克隆形成能力明显下降，且M14/R2.0下降能加显著，提示耐药M14细胞对威罗菲尼产生成瘾性，且成瘾性与耐受的剂量正相关。这与我们前期在耐药A375/R0.5和A375/R2.0的结果相一致。
3.耐药A375和耐药M14细胞的药物成瘾深度与ERK1/2-FRA-1通路活性呈正相关。
撤除威罗菲尼后，我们收集了不同时间点的细胞裂解液，检测了细胞周期调节蛋白P21及ERK1/2通路相关基因的表达，结果发现撤除威罗菲尼可显著激活ERK1/2-FRA-1通路，并与A375/R0.5、M14/R0.5相比，A375/R2.0和M14/R2.0的ERK1/2-FRA-1通路激活更加显著。
4.撤药后耐药A375细胞通过上清液中分泌的细胞因子而介导成瘾性。
收集撤药后的A375/R0.5和A375/R2.0细胞上清液，分别添加到A375/R0.5及A375/R2.0培养液中，发现上清液可抑制耐药A375细胞的克隆形成，且对A375/R2.0的抑制作用更强。相反，对药物敏感的A375细胞上清液可促进A375细胞的克隆形成。
5.耐药A375细胞并非通过细胞衰老而介导成瘾性。
将威罗菲尼从A375/R0.5和A375/R2.0中撤除7d后做SA-β-gal染色。结果表明，在A375/R0.5和A375/R2.0中均未观察到SA-β-gal阳性细胞明显增加。
6.撤药后耐药A375细胞出现细胞增殖抑制。
对耐药A375细胞撤除威罗菲尼培养3d后，用EdU整合实验来研究撤药对细胞增殖的影响。结果表明，相比含威罗菲尼的生长条件，撤除威罗菲尼3天后，A375/R0.5和A375/R2.0细胞的EdU阳性细胞均明显降低，且A375/R2.0降低更明显。
【结论】
1.建立了对威罗菲尼耐药的黑色素瘤耐药细胞株M14/R0.5及M14/R2.0，二种细胞株均对威罗菲尼具有成瘾性。
2.耐药黑色素瘤A375细胞和M14细胞对威罗菲尼的成瘾程度与细胞耐受的药物剂量成正比，也与撤药后ERK1/2-FRA-1通路激活程度呈正比。
3.耐药黑色素瘤细胞通过上清液中分泌细胞因子介导成瘾性。
4.撤药可通过抑制细胞增殖，而非诱导细胞衰老而介导药物成瘾性。
探讨对威罗菲尼(vemurafenib)耐药的黑色素瘤细胞，其药物成瘾程度与药物耐受剂量之间的关系，并探究介导二者间相关性的分子和生物学机制。
【方法】
1.耐药黑色素瘤细胞：通过连续在黑色素瘤M14细胞生长液中添加0.5μmol/L或2μmol/L威罗菲尼，建立耐药细胞株M14/R0.5和M14/R2.0。另外实验室前期保存有对威罗菲尼耐药的黑色素瘤细胞株A375/R0.5和A375/R2.0。以相应的敏感细胞A375和M14为阴性对照。
2.克隆形成实验：将黑色素瘤细胞种于12孔板中，添加或不添加相应浓度的威罗菲尼，每周更换两次培养基，当克隆形成明显时，用结晶紫染色。拍照后，用33%醋酸溶液溶解结晶紫，用酶标仪在590nm处检测吸光度。以观察两种耐药细胞是否对威罗菲尼产生成瘾性。
3.Westernblot实验：通过Westernblot实验分析撤除威罗菲尼后，对黑色素瘤耐药株ERK1/2-FRA-1通路的影响。
4.上清液收集及克隆形成实验：在A375/R0.5和A375/R2.0培养过程中收集威罗菲尼撤药4天后的细胞上清液，将收集到的上清液分别添加到对应细胞的培养液中，观察耐药细胞分泌的细胞因子是否介导药物成瘾性。
5.衰老染色实验：通过对耐药细胞撤除或不撤威罗菲尼培养4天后，做衰老染色检测。用PBS清洗细胞并在室温下固定15分钟，用PBS洗涤细胞后，在37℃下用衰老染色染液孵育过夜，并用显微镜拍照。
6.细胞增殖实验：通过对耐药细胞撤除威罗菲尼或不撤药培养，4天后做EdU检测。细胞在37℃用EdU处理4h，用4%多聚甲醛固定后，用PBS冲洗，将100μL的1×Apollo?反应液加入孵育30min，然后用Hoechst33342染细胞核。使用荧光显微镜拍摄图像，并用ImageProPlus6.0软件评测EdU的整合率。
【结果】
1.成功构建了对威罗菲尼耐药的黑色素瘤株M14/R0.5和M14/R2.0。M14/R0.5以及M14/R2.0细胞状态良好，在含有威罗菲尼的生长液中生长速度快。
2.耐药M14细胞对威罗菲尼具有成瘾性。
克隆形成实验显示，在M14/R0.5和M14/R2.0细胞的培养过程中，撤除威罗菲尼后，细胞的克隆形成能力明显下降，且M14/R2.0下降能加显著，提示耐药M14细胞对威罗菲尼产生成瘾性，且成瘾性与耐受的剂量正相关。这与我们前期在耐药A375/R0.5和A375/R2.0的结果相一致。
3.耐药A375和耐药M14细胞的药物成瘾深度与ERK1/2-FRA-1通路活性呈正相关。
撤除威罗菲尼后，我们收集了不同时间点的细胞裂解液，检测了细胞周期调节蛋白P21及ERK1/2通路相关基因的表达，结果发现撤除威罗菲尼可显著激活ERK1/2-FRA-1通路，并与A375/R0.5、M14/R0.5相比，A375/R2.0和M14/R2.0的ERK1/2-FRA-1通路激活更加显著。
4.撤药后耐药A375细胞通过上清液中分泌的细胞因子而介导成瘾性。
收集撤药后的A375/R0.5和A375/R2.0细胞上清液，分别添加到A375/R0.5及A375/R2.0培养液中，发现上清液可抑制耐药A375细胞的克隆形成，且对A375/R2.0的抑制作用更强。相反，对药物敏感的A375细胞上清液可促进A375细胞的克隆形成。
5.耐药A375细胞并非通过细胞衰老而介导成瘾性。
将威罗菲尼从A375/R0.5和A375/R2.0中撤除7d后做SA-β-gal染色。结果表明，在A375/R0.5和A375/R2.0中均未观察到SA-β-gal阳性细胞明显增加。
6.撤药后耐药A375细胞出现细胞增殖抑制。
对耐药A375细胞撤除威罗菲尼培养3d后，用EdU整合实验来研究撤药对细胞增殖的影响。结果表明，相比含威罗菲尼的生长条件，撤除威罗菲尼3天后，A375/R0.5和A375/R2.0细胞的EdU阳性细胞均明显降低，且A375/R2.0降低更明显。
【结论】
1.建立了对威罗菲尼耐药的黑色素瘤耐药细胞株M14/R0.5及M14/R2.0，二种细胞株均对威罗菲尼具有成瘾性。
2.耐药黑色素瘤A375细胞和M14细胞对威罗菲尼的成瘾程度与细胞耐受的药物剂量成正比，也与撤药后ERK1/2-FRA-1通路激活程度呈正比。
3.耐药黑色素瘤细胞通过上清液中分泌细胞因子介导成瘾性。
4.撤药可通过抑制细胞增殖，而非诱导细胞衰老而介导药物成瘾性。