分子识别是生物系统中最基本和普遍存在的化学事件。近年来,核酸适体作为一种重要的分子识别探针,已被证明是生物医学领域不可或缺的工具,可应用于免疫疗法反应预测、肿瘤检测分析和病毒中和抑制等。然而,随着相关研究的深入,研究者们也遇到了一些新的研究挑战,例如:如何获得高灵敏、高性能、结构及功能可控的核酸适体,且如何高效率获得核酸适体,仍是核酸适体领域的中心任务和重要挑战。针对这一任务和挑战,本论文以发展新型高效核酸适体定向进化方法及其在生物医学中的应用为核心,开展以下工作:一、外泌体PD-L1含量的均相检测方法免疫疗法给癌症治疗带来了革命性的变化,但由于缺乏有效的预测因子,其疗效受到严重阻碍。为此,本论文建立了一种均相、小体积、高效、灵敏的外泌体PD-L1 含量检测方法HOLMES-ExoPD-L1（homogeneous,low-volume,efficient,and sensitive exosomal PD-L1）,可用于癌症诊断和免疫疗法反应预测。PD-L1蛋白是高度糖基化的,HOLMES-ExoPD-L1采用以不经过翻译后修饰的PD-L1蛋白定向进化获得的核酸适体为识别分子,该核酸适体识别的是裸露的多肽抗原而不是翻译后修饰的蛋白,从而易于穿过糖基化修饰的PD-L1,提高PD-L1识别效率;其次,HOLMES-ExoPD-L1利用具有快速结合动力学的均相微量热泳法进行检测,能提高检测灵敏度。基于游离核酸适体与结合PD-L1外泌体的核酸适体在微量热泳动效应诱导下的温度场中具有不同分布情况,从而达到无需分离洗涤就可定量检测外泌体PD-L1。基于HOLMES-ExoPD-L1检测到的循环外泌体PD-L1的表达水平可以把癌症患者和健康人进行区分,并首次发现腺癌患者外泌体PD-L1浓度与肿瘤转移呈正相关。与现有的检测外泌体PD-L1的方法ELISA相比,HOLMES-ExoPD-L1提高了检测灵敏度,也更省时、易操作。因此,HOLMES-ExoPD-L1为早期癌症诊断和免疫疗法反应预测提供了新方法和新思路。二、PD-L1特异性糖基化的原位可视化方法为了实现PD-L1特异性糖基化的可视化,基于定向进化获得的不受糖基化阻碍的PD-L1核酸适体,本论文发展了一种PD-L1特异性糖基化原位可视化方法 FLAG（a FRET strategy based on a lectin for glycan labelling and the aptamer for PD-L1 polypeptide antigen labelling,offering visualization of PD-L1-specific glycosylation）。该方法利用PD-L1核酸适体空间位阻小以及无代谢凝集素标记,可在组织切片上原位观察蛋白质特异性糖基化。FLAG策略已被用于可视化肺癌组织切片上PD-L1特异性糖基化的状态和分布。这种无需代谢标记且简单易行的策略不仅限于科学研究,且容易推广到临床实践。因此,FLAG策略提供了一个强大的工具,可揭示PD-L1糖基化在肿瘤诊断中的重要性,有望为免疫检查点抑制剂的开发提供新思路,并确定新的生物标记物以预测将从免疫检查点治疗中受益的患者。而且,通过简单地替换靶向核酸适体或者蛋白配体的类型,FLAG策略可以应用于更广泛的领域。三、焓变驱动核酸适体定向进化新方法焓变驱动适体是复杂环境中理想的应用探针,在生物医学应用中具有较高的亲和力和选择性。然而,目前还缺乏直接发现焓变驱动适体的方法。因此,本论文发展了一种分子拥挤筛选新方法（Molecular Crowding SELEX）来定向进化焓变驱动适体。针对肿瘤生物标志物EpCAM蛋白成功进化了三个核酸适体序列,并通过热力学分析证明它们都是焓变驱动的,从而确立了分子拥挤SELEX有效发现焓变驱动适体的可行性。进一步比较在传统SELEX（SYL-3C适体）和分子拥挤SELEX（SYL-H2C适体）中进化出的核酸适体,发现SYL-H2C的亲和力是SYL-3C的6.5倍。利用其改进的热力学性质,焓变驱动的SYL-H2C适体能够以优异的检测准确率（10/10）检测到癌症患者血液样本中的循环肿瘤细胞。因此,所提出的Molecular Crowding SELEX为在生物医学中发现强健的结合探针提供了一个有前途的方向。四、小分子激活核酸适体定向进化新方法为了获得结构及功能可控的核酸适体,本论文提出了“clipped aptamer”的概念并发展了“clipped aptamer”的定向进化过程“Clipped Aptamer SELEX”。通过“Clipped Aptamer SELEX”直接进化获得了针对肿瘤生物标志物EpCAM蛋白的“clipped aptamer”。“Clipped aptamer”利用了 DNA 错配结合分子胶水（Z-NCTS）与DNA序列中预设的CGG/CGG位点之间的特异性识别,可以快速地将DNA序列中的两个CGG位点“clipped”在一起,引发理想热力学条件下靶标非结合态到结合态的结构转变。通过实验及分子对接模拟进行探究验证,结果表明,“clipped aptamer”确实可通过Z-NCTS时空调控其三维结构变化,实现从与EpCAM结合的非活性状态到活性状态的有效转变,从而精准调控细胞黏附。因此,“clippedaptamer”在生物传感、成像、细胞行为调控以及药物传递方面具有巨大的潜力。此外,该筛选方法理论上可直接进化获得任何靶标的构象调控核酸适体,避免常规方法中的序列设计试错,为构筑结构及功能可控的核酸适体的研究提供了新思路。五、双特异性中和适体抑制SARS-CoV-2病毒感染SARS-CoV-2发生变异导致传染能力增强,迫切需要开发针对SARS-CoV-2及其变异株的新中和剂。为了进一步提高核酸适体抑制SARS-CoV-2及其变异株侵染的能力,本论文通过DNA自组装设计了双特异性中和适体,以协同抑制SARS-CoV-2 RBD与ACE2的相互作用,从而高效中和SARS-CoV-2。利用两条异源适体的同时识别,双特异性中和适体对SARS-CoV-2RBD的亲和力增强（Kd值为4.8 nM）,对SARS-CoV-2假病毒具有较强的中和作用（半数抑制浓度为8.2 nM）。由于双特异性中和适体良好的亲和力、生物安全性和稳定性以及低免疫原性,双特异性中和适体具有灵活的中和效力,也能很好地中和假型SARS-CoV-2变异株。此外,该双特异性中和适体可通过作为单体构建块,扩展到DNA四面体、正二十面体、金纳米颗粒等纳米器件上,进一步提高中和新冠病毒的能力。因此,该双特异性中和适体封闭策略为抗新冠病毒感染机制的发展提供了新方向。