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大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、链球菌、胸膜肺炎放线杆菌、猪葡萄球菌是猪场中主要的致病细菌,致病性与其毒力基因密切相关。本研究分别以每种细菌特异性毒力基因的高度保守区设计引物,建立监测猪场主要病原菌污染的多重PCR方法。 选择参考毒株大肠杆菌的LTa、STa、STb基因,链球菌2型的CPS2J基因,沙门氏菌的spvR基因,多杀性巴氏杆菌的kmt基因,胸膜肺炎放线杆菌的ApxIVA基因,分离鉴定的猪葡萄球菌nuc基因为目的基因设计引物。对每一对引物的浓度、退火温度进行优化。以大肠杆菌三个基因引物浓度分别为0.2μmol/L、0.4μmol/L、0.4μmol/L,链球菌2型引物为0.1μmol/L,猪葡萄球菌引物为0.2μmol/L,退火温度为49.4℃,建立了五重PCR方法,重复性好,最低检出量依次为:10-5 ng/μL、10-3ng/μL、10-1 ng/μL、10-3ng/μL、10-3ng/μL。以沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌的引物浓度分别为0.4μmol/L、0.2μmol/L、0.8μmol/L,退火温度为50.6℃,建立了三重PCR方法,重复性好,最低检出量依次为:10-3ng/μL、10-6ng/μL、10-2ng/μL。用建立的两种多重PCR方法分别对大肠杆菌参考毒株CVCC196、CVCC209、CVCC1519、CVCC1495,沙门氏菌参考菌株CVCC503、CVCC541,多杀性巴氏杆菌参考菌株CVCC1746,副猪嗜血杆菌参考菌株CVCC3728,链球菌2型参考菌株CVCC606,胸膜肺炎放线杆菌参考菌株CVCC268和分离毒株猪葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、链球菌各一株进行检测,结果表明两种多重PCR方法均具有良好的特异性。 人工模拟污染环境中细菌监测,选用大肠杆菌,采用压缩式雾化器进行雾化,细菌浓度108 CFU/m3。用气体采样泵收集空气,流量6L/min,收集液为20 mL pH7.4 PBS缓冲液,收集时间30min。超滤法浓缩细菌,细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA。应用构建的多重 PCR方法对其样品进行监测,结果显示大肠杆菌的最低检出量为6CFU/mL,表明建立的多重PCR方法可用于空气样品的监测。 应用建立的两种多重PCR方法对采自延津、济源、驻马店、三门峡4个猪场环境中的44份空气样品及济源某猪场12份粪便样品进行监测,空气样品中济源检出LTa、STa阳性各6份,各占13.6%;spvR阳性4份,占0.90%;驻马店检出CPS2J阳性10份,占22.7%;三门峡检出kmt阳性5份,占11.4%;济源某猪场12份粪便样品中, LTa、STa、spvR阳性各2份,各占16.7%。与单项PCR检测结果符合率达100%。 本研究建立了针对产肠毒素大肠杆菌、链球菌、猪葡萄球菌的五重 PCR监测方法和针对具毒性质粒沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌的三重 PCR监测方法,为及时掌握猪场清洁状况,建立有效的预警机制奠定了基础,对有效预防猪病的发生具有重要意义。