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第一部分 子宫内膜异位症合并不孕与生物钟基因表达的关系目的:子宫内膜异位症（EMS）是导致女性不孕的常见病、多发病,已有文献报道EMS导致不孕与长期倒夜班等生物节律紊乱有关。生物节律的调控是由一类称为生物钟系统的蛋白质所介导,它们能够适应光照等昼夜变化从而参与众多的生理过程。因此,本部分旨在明确EMS导致不孕与生物钟基因表达水平的关系。方法:收集9名EMS合并不孕患者以及10名正常生育妇女的分泌中期子宫内膜组织,实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测7个生物钟核心基因的mRNA表达的水平。收集已育妇女月经周期不同时期的子宫内膜组织,qRT-PCR检测PER1 mRNA表达的水平。人永生化子宫内膜基质细胞体外诱导蜕膜化后,qRT-PCR和Western Blot（WB）检测生物钟基因PER1以及蜕膜化标记分子催乳素（PRL）和胰岛素样生长因子结合蛋白1（IGFBP1）mRNA和蛋白的表达。人永生化子宫内膜基质细胞体外诱导蜕膜化后,每4小时收集一次细胞,一共收集32小时,qRT-PCR检测7个生物钟核心基因mRNA水平的动态变化。结果:EMS患者分泌中期子宫内膜组织中生物钟基因PER1 mRNA的表达明显低于正常生育妇女。已育妇女子宫内膜组织PER1 mRNA的表达在增殖期较低,进入分泌早期后逐渐升高,在分泌中期和晚期均有很高的表达。体外诱导人永生化子宫内膜基质细胞发生蜕膜化后,PER1和蜕膜化标志分子PRL、IGFBP1的mRNA和蛋白表达逐步稳定的升高。免疫荧光染色显示,在人永生化子宫内膜基质细胞增殖状态时PER1蛋白在胞浆和胞核中均呈弱表达,诱导蜕膜化后表达显著增高,定位主要在胞核中,这种表达模式与PER1蛋白在人早孕期蜕膜细胞的表达模式一致。在人永生化子宫内膜基质细胞增殖状态下,生物钟多个核心基因没有表现出明显的以大约24小时为循环的表达周期性,诱导分化后也没有显著的表达振幅的改变。结论:EMS患者生育力降低可能与生物钟基因PER1表达下降有关。生物钟基因PER1的表达上调是子宫内膜基质细胞发生蜕膜化的一个显著的特征。生物钟基因PER1可能同时参与了蜕膜化启动和蜕膜化维持这两个过程。第二部分 生物钟基因PER1对人子宫内膜基质细胞蜕膜化的影响目的:已知分泌中期子宫内膜最主要的变化是基质细胞发生蜕膜转化。基于EMS不孕患者分泌中期子宫内膜的生物钟基因PER1表达下调,我们猜想PER1表达下调导致了子宫内膜基质细胞蜕膜化异常。本部分旨在验证生物钟基因PER1能够调控蜕膜发育的假设。方法:收集新鲜的人子宫内膜组织进行原代基质细胞体外分离和培养,siRNA敲降PER1表达后诱导蜕膜化,qRT-PCR和WB检测PER1、IGFBP1和PRL mRNA及蛋白的水平;显微镜下观察并计数蜕膜细胞的体积。同时,我们采用CRISPR/Cas9技术构建PER1基因敲除（PER1-KO）的人永生化子宫内膜基质细胞系,WB检测PER1-KO细胞PER1蛋白的表达;收集体外诱导蜕膜化的PER1-KO人永生化子宫内膜基质细胞,WB检测PRL和IGFBP1蛋白的表达水平。结果:波形蛋白染色阳性和角蛋白染色阴性证实原代基质细胞培养成功。PER1敲降后PER1 mRNA和蛋白水平均显著降低,同时也伴随着IGFBP1和PRL mRNA水平显著降低,细胞体积显著低于对照组。PER1-KO人永生化子宫内膜基质细胞的PER1蛋白表达基本消失,说明PER1敲除细胞系建系成功,进行体外诱导蜕膜化后,PRL和IGFBP1蛋白的水平较对照组显著降低。结论:PER1表达降低导致子宫内膜基质细胞蜕膜化受损。第三部分 生物钟基因PER1影响人子宫内膜基质细胞蜕膜化的机制目的:人子宫内膜基质细胞蜕膜化过程中,多种生长因子、转录因子、细胞因子等共同参与,共同促进蜕膜细胞分化的顺利进行。那么这些因子是否是生物钟基因PER1的下游分子尚未可知。已知生物钟蛋白都是转录因子,PER1是否通过转录调控机制影响下游分子的表达有待证实。方法:人原代子宫内膜基质细胞PER1敲降并诱导蜕膜化后,qRT-PCR检测FOXO1mRNA水平,WB和免疫荧光染色检测FOXO1蛋白的表达。人原代子宫内膜基质细胞PER1敲降并诱导蜕膜化后,WB检测FOXO1上游分子Akt和p-Akt蛋白的表达。收集体外诱导蜕膜化的PER1-KO人永生化子宫内膜基质细胞,加入蛋白合成抑制剂CHX后,WB检测FOXO1蛋白水平的变化;以及加入CHX的同时分别加入多种蛋白降解抑制剂,WB检测FOXO1蛋白的表达水平。敲降PER1同时过表达FOXO1后,WB检测FOXO1和IGFBP1蛋白的水平变化。结果:PER1表达降低对FOXO1 mRNA水平没有影响,但是显著降低了FOXO1蛋白的表达。免疫荧光染色结果显示,PER1表达降低后蜕膜细胞体积显著小于对照组,胞核和胞质中FOXO1表达也明显低于对照组。PER1表达降低后,FOXO1上游分子Akt和p-Ser473 Akt蛋白表达无差异。PER1表达降低组FOXO1蛋白降解比对照组早1h。钙蛋白酶抑制剂MG101能够有效抑制FOXO1蛋白的快速降解,而蛋白酶体抑制剂MG132、自噬抑制剂3-MA则不能。PER1表达降低同时过表达FOXO1后,FOXO1和IGFBP1蛋白表达水平均显著升高。结论:人子宫内膜基质细胞PER1表达降低导致蜕膜化受损是通过降低FOXO1蛋白的表达来实现的。PER1表达降低影响了FOXO1的蛋白稳定性,主要通过钙蛋白酶降解途径来实现。第四部分 P4-PR信号通路调控生物钟基因PER1表达的机制目的:子宫内膜基质细胞蜕膜化过程中,类固醇激素孕酮（P4）的作用至关重要。由于生物钟系统能够感应激素的动态变化,维持机体内环境稳态,由此我们猜想生物钟基因PER1可能参与了P4调控蜕膜化的过程。本部分验证了生物钟基因PER1响应孕酮信号来调控蜕膜发育的假设。方法:使用不同诱导剂诱导蜕膜化,qRT-PCR检测PER1 mRNA的水平变化。使用不同诱导剂诱导蜕膜化同时加入孕酮受体（PR）抑制剂RU486,qRT-PCR检测PER1mRNA的表达。利用CRISPR/Cas9技术构建PGR基因敲除（PGR-KO）的人永生化子宫内膜基质细胞系,WB检测PGR-KO细胞的PRA/PRB蛋白和PER1蛋白表达,qRT-PCR检测PGR-KO细胞PRL和IGFBP1 mRNA的表达。MPA（一种P4类似物）诱导PGR-KO细胞发生蜕膜化后,qRT-PCR检测PER1 mRNA水平变化。qRT-PCR检测PER1-KO细胞PGR、DKK1和HTBS1 mRNA的表达变化。ChIP-PCR寻找PER1启动子区域可能的PRE结合序列,并通过双荧光素酶报告基因实验检测PR影响PER1转录的活性。结果:db-cAMP（一种cAMP类似物）诱导人永生化子宫内膜基质细胞蜕膜化时PER1 mRNA水平较低,而MPA能显著增加PER1 mRNA的表达,db-cAMP和MPA联用时PER1 mRNA水平更高。加入RU486后能够显著降低MPA诱导和MPA联合db-cAMP诱导的PER1 mRNA水平。PGR-KO人永生化子宫内膜基质细胞系PRL和IGFBP1 mRNA表达显著降低,证实建系成功。MPA诱导PGR-KO细胞蜕膜化后,PER1mRNA水平显著低于对照组。PER1-KO细胞PGR mRNA的表达无变化,但是DKK1和HTBS1的表达水平均显著降低。ChIP-PCR结果显示PER1 pormoter序列-1780至-1644bp和-500至-350bp片段有明显的结合,双荧光素酶报告基因实验发现-500至-350bp片段的活性显著高于对照组并能被PGR过表达载体转录激活。结论:人子宫内膜基质细胞蜕膜化过程中PER1的表达主要受到P4的调控。PER1表达降低导致P4-PR信号通路的响应性降低。PR能与PER1 promoter区域直接结合而促进PER1的转录。