论文部分内容阅读
传统的基因组修饰技术中常用的是同源重组和逆转录病毒介导法，由于这些方法存在效率低、特异性差、病毒整合到基因组等问题，制约了其在研究中的应用。锌指核酸酶（Zinc-finger nucleases，ZFNs）技术是一种能够实现内源基因的定向敲除和外源基因高效定向插入的新兴基因组修饰技术，含有锌指蛋白DNA结合域和非特异性核酸酶FokI结构域。TALE核酸酶（TALE nucleases，TALENs）是继ZFN技术以来的另一种能够对基因组进行高效定点修饰的新技术。TALEN技术是基于植物病原体黄单胞菌（Xanthomonas）分泌的一种转录激活子样效应因子（transcription activator–like effectors，TALEs）而设计和构建的人工核酸酶。TALENs是利用了TALE蛋白中的DNA结合域与Fok I核酸内切酶的切割域融合，从而能够设计和构建在特定位点产生双链断裂的人工核酸酶。研究结果显示人工构建的ZFNs和TALENs能够对动植物细胞的基因组进行高度特异和高效的修饰。ApoE蛋白是一种多态蛋白。已有许多报道ApoE缺陷或其基因变异与冠心病、老年性痴呆及老化等疾病有关，会使患者发生严重的高胆固醇血症和动脉粥样硬化。由于猪和人同源性较高，因此本研究以猪ApoE基因为靶基因，利用ZFN技术和TALEN技术靶向修饰猪细胞基因组的ApoE基因，比较两种基因组定点修饰技术的效率，为建立更为有效地转基因方法及生产转基因猪疾病模型奠定基础。获得了如下结果：（1）利用CoDA方法设计了两对能够特异识别猪ApoE基因的ZFNs，构建真核表达载体，并利用酵母报告系统验证特异性锌指核酸酶的活性。通过转染HEK293细胞，检测ZFNs具有切割活性。（2）在ApoE基因的ZFNs识别的相同区域，利用PCR方法和酶切-酶接的方法，组装了12连体TALE，将构建的TALE与pST-TALEN-Backbones连接，构建真核表达载体。将TALEN表达载体和报告载体共转染HEK293细胞，检测到TALEN可以在真核细胞中工作。