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脑神经化学过程的研究是涉及分析化学、生命科学等多种学科相互交叉的前沿研究领域。分析化学的发展促进了脑神经科学的发展,同时脑神经科学的发展也给分析化学提供了更多的机遇和挑战。目前,虽然微透析活体取样-在线伏安法检测和活体伏安法可以用于脑神经化学过程的研究,但是这些方法仍然存在一定的局限性,因此仍需进一步发展基于新原理和新材料的活体分析方法。本论文旨在针对活体分析的要求发展新型、有效的非伏安型活体分析方法。针对活体分析中存在的瓶颈问题,本论文基于化学基本原理和化学生物传感器技术,结合微透析活体取样技术发展了活体在线化学发光分析方法;结合离子选择性电极法发展了原位活体电位分析法;针对伏安法存在的问题并基于无限配位聚合物这种新材料发展了“一步修饰法”用于制备脱氢酶型活体在线电化学传感器,并探讨了其中部分方法在脑生理和病理研究中的应用。具体工作可以概括如下:
(1)活体在线化学发光分析:利用抗坏血酸(AA)对鲁米诺-过氧化氢化学发光体系的猝灭作用,提出并建立了AA的化学发光分析原理,通过与活体微透析技术联用,实现了鼠脑内AA的活体在线分析。利用所建立的方法研究了水杨酸钠诱导的耳鸣过程中鼠脑皮层AA浓度变化规律。实验发现,腹腔注射水杨酸钠3h后,脑透析液中AA的浓度升高了约3倍。本研究拓宽了脑化学活体分析的研究范围,为脑化学的研究提供了新的方法。
(2)钙离子活体电位分析法:利用离子选择性电极法,提出并建立了一种原位检测鼠脑内神经化学物质的活体电位分析法,可用于鼠脑内Ca2+的原位活体分析。将钙离子载体Ⅱ(ETH129)作为敏感膜修饰在碳纤维微电极上,制成电位型活体分析传感器,将传感器植入鼠脑皮层后,测得鼠脑细胞外液中Ca2+的浓度约为1.20±0.05mM(n=3)。在此基础上,利用所建立的方法研究了大鼠在全脑缺血/再灌注过程中细胞外液中钙离子的变化情况。实验发现,大鼠在全脑缺血1h后,脑内钙离子浓度下降至基础值的40.9±2.5%(n=3);再灌注1h后,钙离子浓度下降至基础值的16.7±1.6%(n=3)。本方法为研究钙离子相关的生理、病理事件提供了可能。
(3)基于无限配位聚合物(ICP)的活体在线电化学分析:利用Tb3+与辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)之间的自组装作用,将生物传感元件(电催化剂、酶和辅酶)包裹在一起,制备了具有生物电化学活性的无限配位聚合物(ICP)。在此基础上,通过将单壁碳纳米管(SWNTs)与ICP复合,提出并建立了基于脱氢酶的活体在线电化学分析方法。由于ICP纳米粒子与SWNTs复合形成了三维导电网络结构,有效地提高了传感器的灵敏度。利用基于ICP/SWNT的生物传感器,构建了活体在线电化学分析方法,并实现了豚鼠脑内葡萄糖的活体在线分析。本研究为脑化学的活体分析提供了新的电化学分析方法,有望在与生理和病理过程相关的分子机制的研究方面得到广泛应用。