论文部分内容阅读
2,3,7,8-四氯代二苯并-对-二噁英(TCDD)可以通过胎盘和乳汁向下一代传递,在直接暴露的个体及其子代中引起严重的异常生理和功能性改变。已有研究证实了胎儿发育中的环境因素刺激可诱导基因组的表观遗传调控的长期改变,造成表型的跨代遗传效应。目前宫内TCDD暴露对大鼠体细胞组织印记基因改变的跨代遗传效应尚未有报道;宫内TCDD暴露是否能够造成子代的空间学习记忆损伤,该效应是否能够跨代传递,亦尚未有文献报道。目的探索性腺性别决定期宫内TCDD暴露对F1-F3代生长发育,以及F1代和F3代雄鼠肝脏印记基因Igf2的影响,进一步研究相关的表观遗传跨代调控机制;并对宫内TCDD暴露对F1-F3代成年大鼠空间学习记忆能力的影响进行研究。方法建立跨代遗传大鼠模型,孕F0代雌性SD大鼠在性腺性别决定期(孕8-14天,GD 8-14)灌胃染毒TCDD,剂量分别为0,200,800 ng/kg bw。F1-F3代仔鼠围产期间测量其顶臀长和尾长;对肛门生殖孔距离(AGD)和体重增长情况进行测定。使用亚硫酸氢钠测序法(BSP)法对F1和F3代雄鼠肝脏组织中Igf2/H19位点两个差异性甲基化区域(ICR,DMR2)的甲基化状态进行测定;使用Real-time PCR法对F1代和F3代雄鼠肝脏印记基因胰岛素样生长因子2(Igf2),DNA甲基转移酶(DNMT1,DNMT3A,DNMT3B)的m RNA表达水平进行测定;使用Morris水迷宫实验测试F1-F3代成年大鼠的空间学习记忆能力。结果1宫内性腺性别决定期TCDD暴露未对F1-F3代窝大小和出生性别比例造成影响,但是造成了F1代雌鼠和雄鼠的出生存活率和哺乳存活率的显著下降,围产期顶臀长和尾长的缩短,围产期和成年期的AGD缩短;这些效应在F2代和F3代子代中仍持续,但随着传代的进行,效应逐渐减弱;2宫内性腺性别决定期TCDD暴露可显著造成F1和F2代的低出生体重以及围产期的体重增长缓慢。体重增长趋势上,高剂量(800 ng/kg bw)TCDD宫内暴露造成F1代大鼠体重持续低于对照组,并随着传代的进行,直至F3代仍出现不同程度的体重增长缓慢现象;而在低剂量(200 ng/kg bw)TCDD宫内暴露后代中则出现了不同程度的体重增长高于同期对照组的现象,并持续到F3代;3宫内TCDD暴露可引起F1-F3代雄鼠(睾丸,附睾,前列腺)和雌鼠(卵巢)的生殖系统脏器重量和脏器系数的不同程度的改变,并随着传代该效应衰减;同时也观察到了宫内TCDD暴露对F1-F3代一般脏器(脾脏,肾脏,心脏,肝脏)的重量和脏器系数的长期影响;4宫内TCDD暴露可造成子F1代和F3代雄鼠肝脏印记基因Igf2的m RNA表达下降。200和800 ng/kg bw TCDD组的F1代雄鼠Igf2的m RNA表达分别为对照组的0.81倍和0.39倍(P<0.05);经过两代雄性生殖系的传递后,F3代Igf2的表达水平仍显示了明显的降低趋势,200和800 ng/kg bw TCDD组F3代雄鼠Igf2的m RNA表达分别为对照组的0.25和0.33倍(P<0.05);5对印记基因Igf2的两个差异性甲基化区域的甲基化程度的分析结果显示,F1代ICR区域甲基化程度随染毒剂量增加而上升,DMR2区域甲基化程度则随剂量增加而下降;并且随着传代的进行,宫内TCDD暴露诱导的ICR和DMR2的甲基化模式的改变在F3代仍呈现相似的趋势;6伴随着印记基因Igf2差异性甲基化区域甲基化模式的改变,建立和维持印记基因表达的DNMTs也受宫内TCDD暴露的影响:F1代DNMT1,DNMT3A和DNMT3B的m RNA表达呈现非单调改变模式,并且该效应在F3代仍凸显;7 Morris水迷宫获得性训练阶段,TCDD宫内暴露组F1-F3代雌雄成年大鼠的潜伏期和游泳路程与对照组相比,具有不同程度的延长现象,该效应持续到F3代仍显示与对照组有微弱的差异;8 Morris水迷宫探查测试中,F1代的800 ng/kg bw TCDD组的雄鼠穿越原平台的次数明显减少,但是该效应并没有在F2,F3代中凸显出来,F1-F3代雌性后代也未出现差异;F1代800 ng/kg bw TCDD组的雌雄成年大鼠在目标象限花费的时间多于对照组;9 Morris水迷宫获得性训练阶段,宫内TCDD作用造成的子代学习记忆能力具有明显的性别差异。F2代TCDD组雄鼠相对于同剂量组的雌鼠花费更长的时间找到隐匿平台;并且在F1代和F2代中,TCDD组雄鼠表现差于对照组的雌鼠,显示了一定程度的雌性化。上述性别差异经历两代传递后衰减。结论1宫内性腺性别决定期TCDD暴露对F1-F3代子代的一般生长发育和AGD造成一定的影响,并随着传代的进行,效应逐渐减弱;2宫内TCDD暴露对子代体重增长的长期影响可能呈现“倒U”现象:TCDD宫内暴露子代体重的增长可能在低剂量作用下得到刺激,出现代偿性生长;而在较高剂量的作用下体重增长受到抑制,该种现象可能会跨代传递;3性腺性别决定期TCDD宫内暴露具有广泛的发育毒性作用,可能扰乱器官形成,对子代生殖系统,免疫系统造成影响,产生肾脏毒性,心脏毒性和肝脏毒性,一些效应还能够持续影响多代,增加疾病风险;4宫内TCDD暴露可能并不直接造成不良妊娠结局,相反的可能对于生长和发育指标产生长久的细微的效应或损伤。靶器官的跨代效应影响可能也涉及表观遗传因素的影响,对于以后的TCDD跨代遗传研究靶标选择上具有一定的提示作用;5性腺性别决定期TCDD宫内暴露可通过扰乱印记基因Igf2的表观遗传修饰,从而造成印记基因表达的改变,并且该印记基因的异常甲基化模式可在传代中逃避基因组的重新甲基化过程,进行跨代遗传;DNA甲基转移酶在TCDD造成的印记基因甲基化模式的跨代遗传传递中起一定的作用;6宫内TCDD暴露可造成F1-F3代雌雄成年大鼠空间学习记忆能力的损伤,具有跨代遗传效应;宫内TCDD暴露诱导的空间学习记忆能力的改变具有性别差异。TCDD子代雄鼠显示了“雌性化”表现,提示TCDD可能通过激素紊乱效应造成雄性子代的神经行为的“去雄化”表现,但是该效应经过两代传递后逐渐衰减。