论文部分内容阅读
微藻油脂是最具潜力的生物柴油原料之一,但目前获取成本高,严重制约了发展。油脂含量是决定微藻生物柴油成本的最重要因素之一。在氮源充足条件下微藻生物量较高但油脂含量较低,如何提高氮源充足条件下微藻的油脂含量是现阶段面临的重要问题。巴夫杜氏藻（Dunaliella parva）是一种单细胞绿藻,它可以积累油脂和大量的类胡萝卜素,适应高盐等逆境条件;它缺乏细胞壁,有利于遗传操作和产物提取;它与模式微藻相比作为生物柴油的原料更具吸引力。前期研究表明限氮能显著诱导巴夫杜氏藻的油脂含量增加,但生物量明显下降,调控机理不明。为解决生物量和油脂含量负相关的问题,本论文研究了限氮条件下巴夫杜氏藻转录组和蛋白组的变化,以挖掘油脂合成途径重要的关键酶基因和调控基因,为通过操纵调控基因实现微藻生物量和油脂含量的双增长奠定基础。本论文采用单因素实验优化了巴夫杜氏藻的培养条件。结果表明,硝酸钠和氯化钠在实验浓度范围内对巴夫杜氏藻的生长有显著的影响,碳酸氢钠、氯化钾、硫酸镁、氯化钙、柠檬酸铁、A5溶液和pH值对藻的生长影响较小。硝酸钠浓度对巴夫杜氏藻生长的影响为下一步选择氮源充足和限氮条件奠定了基础。本论文利用Illumina HiSeq2000平台对氮源充足（5.0mM硝酸钠,对照SCH-5.0mMA）和限氮条件（0.5mM硝酸钠,处理SCH-0.5mMA）下的巴夫杜氏藻进行了转录组测序。从对照和处理中分别获得了29380572和29815432个raw reads,过滤后分别获得了26304060和26797446个clean reads。将对照和处理的clean reads用Trinity软件组装,在对照、处理和All-unigene中分别获得了41357、40015和35213个unigene。1000bp以上的unigene在对照、处理和All-unigene中的比例分别为23.08%、28.17%和36.01%。此外,在对照、处理和All-unigene中N50分别为1044bp、1173bp和1346bp。这些结果表明组装质量较好,为后续的基因注释和代谢通路分析奠定了基础。共有24378个unigene含有300bp以上的CDS,占总数的93.27%,表明了拼接的高质量。最终获得了35213个unigene,平均长度为916bp,N50为1346bp。将获得的unigene与Nr、Nt、Swiss-Prot、COG、GO及KEGG等数据库进行比对,共有21568个unigene被注释。糖类代谢、能量代谢、氨基酸代谢及核苷酸代谢等初级代谢途径鉴定的unigene较多,构建的代谢途径较完整。由于次级代谢途径中基因的表达水平较低,鉴定的unigene较少,构建的代谢途径相对不完整。综合COG、GO及KEGG三种分类方法可以对unigene的潜在功能有比较全面的了解,为将来深入研究特定目标基因奠定了重要的基础。本论文分析了巴夫杜氏藻的对照和处理样品的差异表达基因。两者之间有显著表达差异的unigene有1529个。对差异表达基因进行GO和KEGG分类,发现两者在光合作用、氮素代谢、氨基糖和核糖代谢、RNA运输、淀粉和蔗糖代谢、氨基酸代谢、甘油磷脂代谢、蛋白质加工及核酸组成物质嘌呤和嘧啶的代谢等途径差异显著。两者之间差异表达基因的产物主要位于质体、叶绿体及内囊体等部位。差异表达基因的获得为将来深入研究巴夫杜氏藻中油脂合成响应限氮的机理奠定了基础。本论文分析了巴夫杜氏藻的对照和处理样品的差异表达蛋白。两者之间有显著表达差异的蛋白有386个。对差异表达蛋白进行GO和KEGG分类,发现两者在光合作用、TCA循环、氧化磷酸化、丙酮酸代谢、次级代谢产物合成、氮素代谢、淀粉和蔗糖代谢、糖酵解/糖异生、脂肪酸合成及氨基酸代谢等途径差异显著。两者之间差异表达蛋白主要位于细胞质部分、质体及叶绿体等部位。综合分析对照和处理样品的差异表达基因和差异表达蛋白有助于深入理解巴夫杜氏藻中油脂合成响应限氮的机理。本论文参考KEGG注释信息构建了巴夫杜氏藻的脂肪酸合成途径、三脂酰甘油合成途径及淀粉代谢途径,并分析了三条途径中相关基因表达水平的变化。在差异表达基因中鉴定到油脂合成调控基因wri1的片段及参与油脂分解代谢的Lip基因的片段。根据获得的核心片段,通过RACE方法获得了wri1和Lip的cDNA全长。然后,通过Genome Walking方法获得了它们的启动子序列。采用荧光定量PCR分析了wri1和Lip在对照和处理样品中的表达情况,结果表明限氮可以显著诱导它们的表达,它们可能与油脂的积累密切相关。此外,纯化了wri1蛋白,制备了wri1抗体,用wri1抗体和巴夫杜氏藻的样品进行了染色质免疫共沉淀实验以获得与wri1蛋白结合的基因片段,了解受wri1蛋白调控的下游靶标基因。这些结果为后续的深入研究奠定了基础。本论文研究了对照（氮源充足条件）和处理样品（限氮条件）中转录组和蛋白组的变化,构建了油脂合成途径,鉴定了重要的油脂合成调控基因wri1并进行了相关的研究。同时,研究了参与油脂分解代谢的Lip基因。通过分析限氮条件下巴夫杜氏藻转录组和蛋白组的变化,获得了油脂及淀粉合成途径的基因,鉴定到重要的油脂合成调控相关的转录因子基因wri1。结果表明限氮可以显著诱导wri1和Lip的表达。通过原核表达、亲和纯化、抗体制备及染色质免疫共沉淀等实验获得了转录因子wri1富集的DNA,下一步将进行富集DNA的染色质免疫共沉淀测序。这些结果为将来深入研究油脂合成调控机理及改造巴夫杜氏藻奠定了基础。