论文部分内容阅读
背景学习和记忆是生物个体与生俱来的本领,也是生存的必要能力,是智能提高的重要手段。学习记忆包括信息的获取、巩固、再激活、再巩固或消退等一系列不同的过程。恐惧记忆是众多记忆中重要的一种。恐惧记忆包含记忆发生的全部过程,具有参与调节人类的情绪变化。有研究显示恐惧记忆的“再激活”或“重复激活”能导致抑郁和焦虑样行为,给人类的身心健康造成严重的威胁。因此,揭示恐惧记忆“再激活”的发生机制将对于寻求焦虑、抑郁样行为等症状的治疗具有重要的意义。钙蛋白酶(Calpain)是一类重要的钙离子依赖的蛋白酶,calpain调节其底物在神经功能尤其记忆的获取和巩固中发挥重要作用,然而calpain在恐惧记忆“再激活”中的作用及作用机制尚不清楚。仙茅苷(Curculigoside,CUR)是仙茅—石蒜科多年生草本植物仙茅(Curculigo orchioides Gaertn)根茎的主要活性成分。现代药理学研究表明其药理作用广泛,具有抗氧化、保护心血管、抗骨质疏松、增强免疫功能及神经保护等作用。此外,前期还有报道指出仙茅苷具有抗抑郁和焦虑的作用。本研究拟进一步探讨仙茅苷对恐惧记忆的影响,以期为仙茅苷抗抑郁或焦虑的机制阐明提供参考。1目的研究calpain抑制剂calpeptin对恐惧记忆“再激活”的影响与作用机制;初步探讨仙茅苷对恐惧记忆的影响。2方法行为学研究:通过制作条件恐惧CS-US(Conditioned stimulus-Unconditioned stimulus)模型来模拟记忆的不同过程,并结合不同时间点使用calpeptin(2 mg/kg,i.p.),包括巩固实验(在条件恐惧训练之前、之后分别给药)、再巩固实验(在再暴露5 min之前、之后分别给药)以及消退实验(在再暴露15 min之前、之后分别给药),以凝滞值(Freezing)作为观察恐惧记忆的指标,来研究calpain在学习记忆各个过程中的作用。机制研究:在恐惧记忆“再激活”(暴露15 min)实验中,再暴露前给药calpeptin,通过免疫印迹和免疫荧光实验来检测calpain相关底物PP2A-B56-α、SCOP、PTEN及p-CREB、p-m Tor等激酶的表达变化。仙茅苷干预实验:建立条件恐惧CS-US模型,分别于CS-US前(适应期前)以及CS-US后(再暴露后)两个时间点开始给予仙茅苷(20 mg/kg/d,i.p.,7 days),通过检测小鼠凝滞值的变化,初步探讨仙茅苷对小鼠恐惧记忆的影响。3结果Calpepetin对条件恐惧“再激活”的作用与机制研究:记忆巩固实验,结果显示条件恐惧训练之前给药,calpeptin组小鼠的凝滞值显著低于对照组(P<0.05),而条件恐惧训练之后给药的两组凝滞值之间无显著性差异(P>0.05)。再巩固实验,结果显示再暴露前给药,calpeptin组的凝滞值显著低于对照组(P<0.05);再暴露5 min后给药,calpeptin组的凝滞值与对照组之间无明显差异(P>0.05)。在消退实验中,再暴露前给药,calpeptin组的凝滞值却显著高于对照组(P<0.05);再暴露15 min后给药,calpeptin组的凝滞值亦显著高于对照组(P<0.05)。免疫印迹结果显示,再暴露15 min显著提高杏仁核PP2A-B56-α、p-m Tor、p-CREB蛋白的表达(P<0.05);而calpeptin组再暴露前后的PP2A-B56-α、p-m Tor、p-CREB蛋白表达没有显著差异(P>0.05)。免疫荧光结果显示,p-m Tor和PP2A-B56-α主要表达于杏仁核神经元的胞浆,而p-CREB主要定位于细胞核;再暴露15 min显著提高杏仁核中PP2A-B56-α、p-m Tor、p-CREB阳性细胞数;而calpeptin组再暴露前后的PP2A-B56-α、p-m Tor、p-CREB阳性细胞数没有显著差异。在对照组和calpeptin组,杏仁核中SCOP、PTEN、p-Akt、Akt、p-Erk、Erk蛋白在再暴露前和再暴露后的表达量都没有显著性差异(P>0.05)。仙茅苷对恐惧记忆的影响:CS-US前给药的实验结果显示,仙茅苷组小鼠在再暴露期与测试期的凝滞值与对照组的小鼠比较,无显著性差异(P>0.05);而在CS-US后给药的实验中,小鼠在再暴露后注射仙茅苷7d后再次测得的凝滞值显著高于对照组(P<0.05)。4结论Calpain参与恐惧记忆的“再激活”过程,再暴露前抑制calpain活性可能取消“再激活”引发的记忆再巩固或消退,该调控过程可能和m Tor通路介导的PP2A-B56-α蛋白合成有关;仙茅苷的干预对恐惧记忆有一定影响,在恐惧记忆形成后,其可能具有抑制记忆退化的作用。