研究背景冠心病(Coronary artery disease, CAD)是中老年人常见的一种心血管疾病,其发病率及死亡率高,而且呈逐年上升的趋势,已成为威胁人类健康最严重的疾病之一。CAD的主要病理基础是动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)。内皮屏障功能异常是AS的始动因素而且贯穿AS的整个发生发展过程。血管内皮细胞覆盖在血管腔表面形成一层生理屏障,通过内皮间连接的结构严格控制着血液中生物大分子及血细胞的通过,但在某些生理或病理情况下通透性可以大幅度增加。一旦内皮通透性增加,随后将发生一系列反应,如血浆内的脂质成分通过内皮间隙进入内膜,单核细胞和平滑肌细胞迁移至内膜,进一步损伤血管和促进AS斑块的形成甚至引起斑块破裂。研究表明内皮细胞粘附是关系内皮通透性的关键因素。酪氨酸激酶受体B (Tyrosine kinase receptor B, TrkB)是脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor, BDNF)的高亲和力受体。研究表明TrkB通路除了在神经系统中发挥重要作用,也表达于心血管系统。研究表明TrkB可能参与细胞粘附,将TrkB稳定转染工具细胞导致细胞聚集成团,而且聚集只发生在TrkB和钙粘蛋白同时表达的条件下。内皮细胞粘附除了在血管内皮通透性的调节中发挥重要作用,在血管发育过程也发挥重要作用。敲基因鼠研究表明BDNF-TrkB通路确实影响心脏血管发育：研究发现TrkB基因敲除小鼠表现为心肌内血管明显减少和出生后死亡；BDNF敲基因小鼠表现为内皮细胞凋亡、心肌内出血、降低的心脏收缩力和早期出生后死亡；而BDNF-TrkB过表达则导致小鼠胚胎期心肌内毛细血管的密度显著增加。TrkB是否影响成年血管内皮通透性并参与冠心病的病理过程目前尚不清楚。本研究针对这一问题,研究TrkB与冠心病是否相关,以及其对血管内皮通透性的影响及分子机制。旨在寻找冠心病的新的分子机制,为冠心病的诊断和治疗提供新思路和新靶点。研究目的：1.研究TrkB基因多态与冠心病的相关性,探讨TrkB是否冠心病的新的易感基因。2.研究TrkB通路对血管内皮通透性的影响,旨在发现TrkB在内皮通透性调节中的作用及分子机制。3.阐明TrkB通路在炎性诱导的内皮高通透性中的保护作用,旨在发现保护内皮防止内皮损伤的新靶点。研究方法1.病例和对照收集不同地理区域的冠心病病例-对照志愿者2组。2.基因型分析全血基因组DNA的提取采用标准程序。基因型检测采用实时定量PCR结合Taqman探针技术。3.双荧光素酶报告基因分析应用基因克隆技术构建含TrkB启动子的荧光素酶报告质粒,再经定点诱变技术产生分别含-69C和-69G的PGL3-TrkB-69C和pGL3-TrkB-69G荧光素酶报告质粒。将报告质粒转染到HeLa细胞和人血管内皮细胞48小时后,多功能酶标仪检测荧光素酶的荧光强度。4.人和小鼠动脉粥样硬化斑块内TrkB表达收集动脉粥样硬化病人的主动脉标本。高脂喂养ApoE-/-小鼠8周制备AS模型。制备人及小鼠含动脉粥样硬化斑块的主动脉冷冻切片,使用TrkB抗体并采用常规免疫荧光技术检测TrkB在主动脉斑块的表达定位。5.9型腺相关病毒载体构建通过化学合成多对小干扰RNA,并将其导入内皮细胞筛选出敲除效率最高的一对序列,并将其用于下调TrkB病毒的制备。采用常规基因克隆技术制备TrkB过表达质粒,再采用定点诱变技术对TrkB过表达载体的上述干扰RNA识别区进行修饰,防止外源过表达TrkB被上述干扰RNA降解。将构建好的上调及下调质粒交深圳百恩威公司包装9型腺相关病毒。6.体内内皮通透性分析体内内皮屏障功能检测采用伊文思蓝分析。通过尾静脉注射伊文思蓝45分钟再冲洗掉血管内残留的染料后,分离主动脉并分析血管壁中渗漏的染料多少。7.细胞培养人主动脉内皮细胞培养于内皮细胞培养基；HeLa和293T细胞培养于DMEM加10%胎牛血清。所有细胞培养于37度含5%二氧化碳的培养箱中。8.体外旁细胞通透性分析采用transwell小室检测FITC标记的葡聚糖通过内皮单层进入下室的数量多少。待测标本的荧光值检测(激发波长485nm,吸收波长530nm)应用多功能酶标仪。9.跨内皮迁徙检测采用transwell小室计数T细胞跨过内皮单层进入下室的细胞数量多少,并计算迁徙细胞的百分比。10.慢病毒载体构建采用常规基因克隆技术分别将大鼠TrkB基因和小鼠内皮钙粘蛋白基因的cDNA全长克隆到pCCL. PGK. TetLinker. WPRE’慢病毒载体中。采用脂质体2000的方法将该质粒与ENV质粒(VSV-G),包装质粒(pMDLg/pRRE), and pRSV-REV质粒共转染进293T细胞中进行病毒包装。11.定量PCR定量PCR采用SYBR green染料方法用Light Cycler 2.0 (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)仪器检测,相对定量的计算采用2-△△ACt方法。12.WB分析总蛋白提取采用常规方法。总蛋白经10%SDS-PAGE电泳分离后,电转到PVDF膜上,经奶粉封闭后,分别用Trk、内皮钙粘蛋白、tubulin等一抗孵育4度过夜,之后用HRP标记的二抗孵育,化学发光仪进行条带的成像。13. ChIP分析按照试剂盒说明书,从内皮细胞中提取染色质,然后用Etsl一抗进行免疫沉淀。定量PCR检测沉淀物中钙粘蛋白启动子的含量。14.免疫荧光分析冷冻切片放入4%多聚甲醛中固定10分钟。经常规一抗、二抗和DAPI染色后用荧光显微镜观察。15.统计分析所有统计分析应用SPSS 15.0软件(SPSS, Chicago, IL) 。研究结果1. TrkB-69C＞G基因多态和冠心病相关。我们在两个独立的不同地理区域人群中,比较了冠心病人与非冠心病人TrkB-69C＞G、IVS13+40G＞A两个多态位点的基因型和基因频率。结果表明：在两组人群中TrkB-69C＞G基因多态的基因频率和基因型频率在冠心病及非冠心病人中均显著不同(P<0.05)。多因素logistic回归分析结果表明,在消除性别、年龄和体重指数等混淆因素的影响后,TrkB-69C纯合子患冠心病的风险显著增加(山东组：OR值2.1,95%可信区间1.68-2.62；陕西组：OR值2.0,95%可信区间1.69-2.67)。本研究中TrkB IVS13+40G＞A多态位点未见于冠心病相关。2. TrkB -69C纯合子对应降低的TrkB表达和升高的冠心病风险。我们检测了含-69C或-69G的TrkB启动子对下游荧光素酶基因表达的影响。结果表明,无论-69C或-69G多态,TrkB启动子都能显著启动下游荧光素酶的表达。重要的是,在HeLa细胞和血管内皮细胞中-69C组的荧光素酶活性显著低于-69G组,说明-69C与-69G相比TrkB启动子的活性显著降低。我们的研究结果表明降低的TrkB表达可能和增加的冠心病风险相关。3. TrkB表达于人及ApoE-/-小鼠主动脉斑块的内皮层免疫荧光检测TrkB的表达,结果表明TrkB突出表达于野生型C57小鼠的主动脉内皮层。在ApoE敲基因小鼠早期斑块中,TrkB也突出表达于早期斑块的内皮层。在人主动脉粥样硬化早期斑块中,TrkB突出表达在主动脉内皮。4. TrkB防止ApoE敲基因鼠主动脉血管内皮泄漏首先通过尾静脉注射9型腺相关病毒(AAV9),我们观察到AAV9-control携带的Zsgreen报告基因在小鼠主动脉内皮高效表达,表明病毒高效感染主动脉内皮。随后TrkB的敲除效率检测表明AAV9-shTrkB导致小鼠主动脉TrkB的表达降低93%,而AAV9-TrkB过表达病毒能外源恢复内皮TrkB表达。伊文思蓝分析表明内皮TrkB敲除导致ApoE敲基因鼠主动脉伊文思蓝沉积增加30%,而AAV9-TrkB过表达病毒能防止这一变化。内皮钙粘蛋白表达的检测结果表明AAV9-shTrkB感染导致血管内皮钙粘蛋白的表达降低,而AAV9-TrkB过表达病毒能恢复钙粘蛋白的表达。5.内皮钙粘蛋白是介导TrkB的内皮屏障保护作用的关键分子体外细胞实验发现,TrkB敲除能显著增加FITC标记的葡聚糖的跨内皮扩散、内皮钙粘蛋白空隙形成和T细胞跨内皮迁徙。内皮TrkB敲除还导致钙粘蛋白mRNA和蛋白表达显著降低,而外源TrkB过表达能防止钙粘蛋白降低。最重要的是TrkB敲除导致的增加的FITC-葡聚糖扩散、钙粘蛋白空隙增大和T细胞跨内皮迁徙都能被过表达内皮钙粘蛋白阻止。6. Ets1转录因子介导TrkB活化诱导的钙粘蛋白表达首先我们检测了TrkB信号对Ets1转录因子表达的影响。结果表明TrkB敲除导致显著减少的Ets1表达,相反外源BDNF刺激引起的TrkB活化能够诱导Ets1的表达增加。接下来我们检测了Etsl是否介导BDNF诱导的内皮钙粘蛋白的表达,结果表明Etsl siRNA能有效阻断BDNF诱导的内皮钙粘蛋白的表达。进一步的免疫荧光结果表明BDNF不仅促进Etsl的表达,而且促进其核转位；而TrkB敲除导致降低的Etsl表达和核定位。CHIP分析表明BDNF促进Etsl与钙粘蛋白启动子的结合活性。7. TrkB活化能改善促动脉粥样硬化因子诱导的内皮高通透性我们进一步研究了TrkB信号是否能保护内皮屏障完整抵抗促动脉粥样硬化因子诱导的内皮高通透性,结果表明TrkB活化能防止TNF-α诱导的FITC-葡聚糖跨内皮扩散、内皮钙粘蛋白空隙的形成、T细胞的跨内皮迁徙以及内皮钙粘蛋白表达减少。而且TrkB在TNF-α诱导的内皮高通透性中的的保护作用能被Etsl小干扰RNA和内皮钙粘蛋白小干扰RNA阻断。研究结论1. TrkB-69C＞G基因多态和冠心病相关,TrkB-69C纯合子对应降低的TrkB表达和升高的冠心病风险,提示TrkB可能是冠心病新的易感基因,并在冠心病的发病过程中起保护作用。2. TrkB突出表达在早期斑块的内皮细胞中。3. TrkB信号通过促进Etsl介导的内皮钙粘蛋白合成保护内皮完整。4. TrkB活化能防止促炎因子诱导的内皮高通透性。研究背景动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是冠心病等心脑血管疾病的主要病理基础,表现为大动脉及中动脉的血管内壁出现脂质沉积,形成分散或成片的粥样斑块,造成动脉管腔狭窄,随后斑块破裂出血,可在狭窄的动脉内形成血栓,可导致心梗、缺血性脑卒中发生。因此防止AS的发生发展,对防治心脑血管疾病有重要意义。内皮功能异常是AS的始动因素而且贯穿AS的整个发生发展过程。内皮通透性增加,会导致后续发生一系列反应,如血浆内的脂质成分通过内皮间隙进入内膜,单核细胞和平滑肌细胞迁移至内膜,进一步损伤血管和促进AS斑块的形成。酪氨酸受体B是脑源性神经营养因子BDNF的高亲和力受体。BDNF-TrkB通路在中枢和外周神经元的生存、生长和维持中发挥重要作用。但是除了在神经系统中起作用以外,TrkB还在心血管系统中发挥作用。有研究表明BDNF-TrkB通路能保护心肌防止缺血损伤。还有研究发现TrkB基因敲除小鼠表现为心肌内血管明显减少和出生后死亡;BDNF敲基因小鼠表现为内皮细胞凋亡、心肌内出血、降低的心脏收缩力和早期出生后死亡；而BDNF-TrkB过表达则导致小鼠胚胎期心肌内毛细血管的密度显著增加。我们的研究发现TrkB突出表达在血管内皮并维持内皮完整通过促进内皮钙粘蛋白的表达。与我们的结果一致,Matsuda等也发现添加BDNF在人微血管内皮细胞的培养基中能促进内皮钙粘蛋白的表达。内皮钙粘蛋白在保护血管内皮完整防止动脉粥样硬化发生发展中发挥重要作用。而内皮TrkB信号对血管动脉粥样硬化斑块形成的影响尚无研究结果。本研究主要探讨了AS形成过程中内皮损伤是否影响TrkB的表达,以及TrkB的表达改变是否影响AS斑块的发展及其分子机制,旨在揭示内皮TrkB在AS病理过程中的作用,为AS的防治提供新思路。研究目的：1.研究AS斑块表面内皮TrkB的表达是否发生变化。2.研究抑制小鼠主动脉内皮TrkB的表达对AS斑块发展的影响。3.研究TrkB对血管内皮钙粘蛋白裂解的影响及分子机制。研究方法1.动物研究程序ApoE-/-小鼠通过尾静脉注射不同的9型腺相关病毒颗粒并接受高脂喂养8周以诱导早期动脉粥样硬化斑块。之后取材并进行后续分析。2.油红0染色主动脉及主动脉根的横断切片先用4%多聚甲醛固定,PBS浸洗后,用油红O染色,然后显微镜下观察并分析结果。3.免疫荧光分析冷冻切片用4%多聚甲醛固定,PBS浸洗后,常规封闭、一抗、二抗孵育、及DAPI染色,荧光显微镜下观察分析结果。4.WB分析总蛋白提取,蛋白浓度检测,SDS-PAGE电泳,转膜,然后封闭,一抗二抗孵育,化学发光检测及条带的定量按本室常规方法。5.定量PCR总RNA提取及逆转录采用常规方法。定量PCR采用SYBER GREEN染料方法。相对定量的计算方法采用2-△△ACt。6.细胞培养主动脉内皮细胞用专门的内皮细胞培养基培养。培养条件37度和5%二氧化碳。7.统计分析所有统计分析均应用SPSS 15.0软件(SPSS, Chicago, IL)。研究结果1.动脉粥样硬化斑块表面内皮细胞的TrkB表达是降低的。TrkB在斑块表面内皮细胞的表达显著下降,与野生型无动脉粥样硬化斑块的小鼠主动脉内皮相比,TrkB在斑块表面内皮细胞的表达降低35%。TNF-a或氧化低密度脂蛋白刺激后,主动脉内皮细胞TrkB的表达显著降低。2.在ApoE-/-小鼠血管内皮细胞中TrkB发挥保护血管抗动脉粥样硬化的作用ApoE-/-小鼠通过尾静脉注射携带Zsgreen报告基因的对照AAV9病毒和携带TrkB干扰RNA的AAV9病毒并同时高脂喂养8周。注射病毒后,我们观察到荧光报告基因Zsgreen在ApoE-/-小鼠主动脉斑块内皮层高效表达。WB分析显示TrkB敲除导致其在ApoE-/-小鼠主动脉的表达减少达到91%。大体油红O染色显示TrkB敲除导致主动脉斑块面积显著增加,与对照组相比斑块面积增加达到40%。主动脉根横断切片的油红O染色也显示相似的结果。3. TrkB敲除导致ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块内增加的脂质沉积、巨噬细胞浸润和炎性反应。我们分析了主动脉根切片中油红O染色阳性面积占斑块总面积的比例,结果发现TrkB敲除导致斑块内脂质含量显著增加,与对照组相比脂质含量增加35%。免疫荧光染色显示,TrkB敲除导致斑块内巨噬细胞的含量也显著上升,与对照组相比巨噬细胞的含量增加40%。TrkB敲除导致斑块内促炎标志物,包括NF-kB, ICAM-1, VCAM-1,E-选择素,TNF-a,和IL6的表达显著上升。4. BDNF能够防止TNF-a诱导的内皮钙粘蛋白胞外域脱落通过增加内皮钙粘蛋白与VE-PTP的结合维持内皮钙粘蛋白的酪氨酸去磷酸化状态。TrkB敲除导致斑块内皮钙粘蛋白的蛋白水平降低了79%,但是其mRNA水平却仅降低43%。这个结果提示我们,TrkB敲除可能不仅涉及钙粘蛋白的合成,还影响钙粘蛋白的裂解。我们研究了BDNF-TrkB通路是否抑制钙粘蛋白的胞外域脱落。我们发现BDNF预先孵育能显著减少TNF-a诱导的钙粘蛋白脱落片段的水平,而BDNF的这一作用可被TrkB干扰RNA阻止。我们研究了BDNF对钙粘蛋白酪氨酸磷酸化的影响。结果表明BDNF能显著减少TNF-a诱导的钙粘蛋白酪氨酸磷酸化,而且这一作用能被TrkB干扰RNA阻断。于是我们进一步检测了BDNF是否促进VE-PTP与钙粘蛋白的结合。结果表明用BDNF预先孵育TNF-a刺激的人主动脉内皮细胞能显著增加与内皮钙粘蛋白免疫共沉淀的VE-PTP的水平。在ApoE-/-小鼠中TrkB敲除导致主动脉内皮钙粘蛋白酪氨酸磷酸化显著增加,而与钙粘蛋白免疫共沉淀的VE-PTP显著减少。研究结论1. TrkB是内皮损伤反应因子,在动脉粥样硬化斑块表面内皮TrkB的表达降低。2. TrkB能保护内皮防止早期动脉粥样硬化斑块的发生发展通过同时促进内皮钙粘蛋白的合成和抑制钙粘蛋白的裂解。3. TrkB调节钙粘蛋白裂解的机制是调节钙粘蛋白与VE-PTP的结合和钙粘蛋白的酪氨酸磷酸化。