观赏鱼产业由于其具有低耗水量、低土地要求、技术密集以及高单位产量等特性,具有良好的发展前景。根据联合国粮食与农业组织的估计,全球观赏鱼零售市场预计年销售额约60亿美元,观赏鱼整体的产业及其附属器材等产业所带动的总产值估计约达到150亿美元。近年来,观赏鱼由传统的蓄养模式向更加精致化、生活化以及艺术化发展,而具有靓丽色彩的转基因观赏鱼也打开了新的市场,带来了大量的商机。目前,美国的Yorktown Technologies公司、台湾的邰港科技和芝林企业是全球主要研发转基因荧光观赏鱼的公司。但是他们现阶段的研发主要以淡水鱼为主。黑点青鳉(Oryzias melastigma)又叫印度青鳉或海水青鳉,属于颌针目、异鳉科、青鳉属。鱼体色透明,体长约3.5～4cm,具有较强的环境耐受能力,容易在实验室条件下进行大规模饲养。本研究以黑点青鳉为研究对象,利用To/2转座子体系构建出具有一定观赏性的转基因荧光黑点青鳉家系。主要研究成果如下:(1)针对黑点青鳉受精卵的卵膜较硬,难于进行显微注射这一技术难点,我们不断优化制针参数,摸索注射条件,最终成功构建了可适用于黑点青鳉的显微注射技术体系。再应用Tol2转座子体系,分别将外源基因片段efla-eGFP(绿色荧光蛋白)和efla-mVenus(黄色荧光蛋白)转入黑点青鳉的基因组中。所获得的阳性F0代个体,全身呈现马赛克式的荧光表达模式。将F0代与野生型侧交后,所获得阳性F1代个体,则呈现全身所有细胞均表达荧光蛋白的表型。但不同F1代个体之间呈现显著的荧光强度差异。其中绿色荧光表达最强的家系,在蓝光灯下呈现淡绿色,使该转基因荧光黑点青鳉具备了一定的观赏性。(2)通过克隆获得斑马鱼肌细胞特异表达基因——肌球蛋白轻链2基因(myosin light chain 2 gene,mlc2f)上游1084 bp的启动子序列,再将该序列片段与mCherry(红色荧光蛋白)基因片段以及pminiTol2骨架进行连接,构建pminiTo12-mlc2f-mCherry载体。再应用Tol2转座子体系,将外源基因片段mlc2f-mCherry转入黑点青鳉的基因组中。所获得的阳性F0代个体,全身呈现马赛克式的荧光表达模式。将F0代与野生型侧交后,所获得阳性F1代个体,则呈现所有骨骼肌细胞均表达荧光蛋白的表型。该家系在普通光照条件下就呈现出鲜艳的紫红色,极具观赏性。(3)通过克隆获得黑点青鳉角质鳍条组分actinodin1基因(and1)上游2011 bp的启动子序列,再将该序列片段与eGFP基因片段以及pminiTol2骨架进行连接,构建pminiTol2-and1-eGFP载体。再应用Tol2转座子体系,将外源基因片段and1-eGFP转入黑点青鳉的基因组中。筛选所获得阳性F1代个体,角质鳍条和鳞质鳍条均表达绿色荧光蛋白。更为有趣的是,与鱼鳍活动相关的肌肉也表达eGFP,如背鳍倾肌、尾鳍腹收肌、尾鳍条间肌、臀鳍倾肌、臀鳍缩肌、腹鳍缩肌、腹鳍引肌、肩带深层展肌和肩带浅层展肌等。但该转基因荧光鱼家系无法在普通光照条件下观察到绿色荧光。综上所述,本研究成功构建了 4种转基因荧光黑点青鳉家系,其中mlc2f-mCherry家系表达的荧光强度最高,具备推广应用前景,今后可进一步利用mlc2f启动子与其他荧光蛋白基因结合,构建更多绚丽多彩的转基因荧光黑点青鳉家系。