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帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是仅次于阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease,AD)的第二大中枢神经系统退行性疾病,在60岁以上的中老年人群中最为常见。作为一种日益常见的神经退行性疾病,帕金森病在临床上经常表现为运动障碍、运动迟缓等症状,同时还引起情绪障碍及神经精神症状等精神症状。半个世纪以来,虽然已经出现了以左旋多巴为代表的针对帕金森病的药物,但是目前的治疗方法无法改善疾病的潜在进展,最终仍会招致许多患者呈现愈加严重的运动和精神症状。因而明确帕金森病的潜在机制,并研发有效的治疗药物是治疗帕金森病所要求的必要条件。帕金森病在病理学中的特点是胞内α-突触核蛋白的非正常聚集,进而导致了路易小体和路易神经突的形成。有文章指出,细胞凋亡可能是帕金森病中神经元死亡最重要的机制。通过研究DA能神经元,发现多巴胺能神经元的DNA片段以及凋亡染色质均发生改变,同时在黑质致密部发现Caspase-3的激活增加。同样,在体外实验中也发现抗凋亡蛋白,如Bcl-2可以显著的保护DA能神经元。这些证据都直接或间接的表明细胞凋亡是帕金森病中神经元丢失的主要机制。通过尸检发现了大量细胞凋亡证据的同时,在患者的脑组织中也发现了自噬空泡的积累。越来越多的证据表明,在帕金森病神经元中存在自噬激活的现象。目前在帕金森病中细胞自噬与细胞凋亡之间的关系仍不确定。有研究表明,通过激活细胞自噬能够保护帕金森病神经元,然而又有研究表示,帕金森病神经元中的自噬激活过度是引起帕金森病神经元凋亡的原因之一。对于帕金森病神经元中细胞凋亡与细胞自噬的关系仍需要更加深入的研究。鱼藤酮作为一种环境毒素,常被应用于PD模型的制备,使用鱼藤酮处理细胞或动物后,大量实验观察到了细胞凋亡的发生,同时也在该模型中发现了自噬小泡的聚集。钙离子作为重要第二信使,已被证明与细胞凋亡以及细胞自噬均有密切的联系,在鱼藤酮诱导的帕金森病模型中也观察到了胞内钙离子浓度增加的情况。研究表明,Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶激酶β(Ca2+/Calmodulin-dependent protein kinase kinaseβ,CaMKKβ)/腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)/雷帕霉素靶蛋白(rapamycin target protein,mTOR)信号通路与神经退行性疾病有着紧密的联系,神经元中一旦发生钙超载,会导致其更易发生氧化应激和凋亡,而这也会进一步导致神经元的丢失。同时,在LRRK2基因突变导致的晚发性帕金森病中也发现了Ca2+/CaMKK-β/AMPK/mTOR信号通路激活进而诱导自噬体形成的现象。ST2-104多肽是依照脑衰反应调节蛋白2(Collapsin respon mediator protein 2,CRMP2)的CBD3结构域设计而来的小分子衍生肽,其分子量为3056.6 g/mol。ST2-104多肽的氨基酸序列为RRRRRRRRRRARSRLAELRGVPRGL,由于其特殊的R9结构使其拥有更强的穿膜能力,同时,基于CRMP2的CBD3区域的设计使其具备了强大的靶向性,并使得ST2-104多肽能够特异性地抑制CaV2.2与CRMP2的结合从而抑制神经元中的Ca2+内流,进而抑制钙超载。前期研究已经证明ST2-104多肽能够抑制钙离子内流从而保护阿尔兹海默病以及脑缺血引起的神经元损伤。本研究的目的是明确ST2-104多肽对帕金森病神经元凋亡的影响并探讨其机制。实验方法:在动物水平上:为确定ST2-104多肽在体内对帕金森病神经元的影响,鱼藤酮被运用于制备帕金森病模型。C57/BL6小鼠随机分为:对照(Con)组、鱼藤酮(ROT)组、ROT+ST2-104组。利用网格实验评价小鼠的僵直强度,爬杆实验被用于检测啮齿动物模型的运动能力。Western Blot被用于检测Bax、Bcl-2以及C-caspase-3这三种与凋亡有关蛋白的表达,Beclin-1和LC3-II这两种与自噬有关蛋白的表达,以及信号通路中的关键蛋白CaMKKβ、p-AMPK、p-mTOR的表达。在细胞水平上:进一步探索ST2-104多肽抑制帕金森病神经元凋亡的机制。鱼藤酮被用于处理SH-SY5Y细胞,从而制备细胞损伤模型,在此基础上进一步利用ST2-104多肽干预。细胞分为:对照(Con)组、鱼藤酮(ROT)组、ROT+ST2-104组以及ST2-104组。细胞活性应用MTT实验进行检测,Hoechst 33258染色实验被用于检测细胞凋亡水平,其细胞自噬水平以MDC染色实验进行评价,Ca2+浓度用流式细胞术进行评价,Western Blot实验评价Bax、Bcl-2、C-caspase-3、LC3-II、Beclin-1、CaMKKβ、p-AMPK以及p-mTOR的蛋白表达强度。为明确鱼藤酮诱导的细胞损伤中自噬和凋亡之间的关系,首先应用自噬激动剂雷帕霉素干预,细胞分为:对照(Con)组、鱼藤酮(ROT)组、ROT+ST2-104组、ROT+ST2-104+RAPA组以及RAPA组,并检测自噬和凋亡水平以及自噬与凋亡相关蛋白的表达。之后,应用自噬抑制剂3-MA进行干预,细胞分为:对照(Con)组、鱼藤酮(ROT)组、ROT+ST2-104组、ROT+ST2-104+3-MA组以及3-MA组。实验内容与雷帕霉素组相同。为确定ST2-104多肽是否通过影响CaMKKβ抑制神经元损伤,应用CaMKKβ的抑制剂STO-609进行干预,细胞分为:Con组、ROT组、ROT+ST2-104组、ROT+ST2-104+STO-609组、STO-609组,应用上述同样实验方法检测细胞凋亡和自噬,并进一步用Western Blot检测CaMKKβ、p-AMPK和p-mTOR的蛋白表达。实验结果:在动物水平上:在爬杆实验中,与对照(Con)组比较,鱼藤酮(ROT)组中小鼠爬杆所需时间明显增加(P<0.01),实验结果指示鱼藤酮会导致小鼠的运动功能降低,在网格实验中,ROT组中小鼠的僵瘫持续时间明显增加(P<0.01),表明鱼藤酮能够导致小鼠的僵瘫强度增加。与ROT组比较,ROT+ST2-104组小鼠的攀爬时间明显降低(P<0.05),僵瘫持续时间明显下降(P<0.05),表明ST2-104多肽能够抑制鱼藤酮引起的小鼠运动功能障碍,改善鱼藤酮引起的小鼠僵瘫。与Con组比较,ROT组小鼠脑组织中凋亡相关蛋白Bax和C-caspase-3表达明显增强(P<0.01),Bcl-2则趋势相反(P<0.01);LC3-II和Beclin-1的表达均明显加强(P<0.05,P<0.01),表明鱼藤酮能够增加小鼠神经元中的细胞凋亡和细胞自噬。与ROT组比较,ROT+ST2-104组小鼠脑组织中凋亡相关蛋白Bax和C-caspase-3表达明显降低(P<0.05,P<0.01),Bcl-2表达明显增强(P<0.01);自噬相关蛋白Beclin-1和LC3-II表达明显降低(P<0.05,P<0.01),表明ST2-104多肽能够抑制鱼藤酮诱导的小鼠神经元中的细胞凋亡及细胞自噬。检测信号通路相关蛋白表达后发现,与Con比较,ROT组CaMKKβ和p-AMPK表达明显升高(P<0.05,P<0.01),p-mTOR表达明显降低(P<0.01);与ROT组比较,ROT+ST2-104组该信号通路相关蛋白表达与ROT组完全相反,结果表明,在小鼠神经元中ST2-104多肽能够抑制鱼藤酮诱导的CaMKKβ/AMPK/mTOR信号通路激活,实验结果初步揭示ST2-104多肽可改善帕金森病小鼠行为学变化,抑制神经元凋亡,其机制可能与影响CaMKKβ/AMPK/mTOR信号通路有关。在细胞水平上:MTT实验显示,与对照(Con)组比较,鱼藤酮(ROT)组细胞经5μM鱼藤酮处理24 h后,细胞死亡增加,细胞活性明显降低(P<0.05);与鱼藤酮组比较,ROT+ST2-104组细胞经5μM ST2-104多肽预处理30 min,再与5μM鱼藤酮共孵育24 h后,细胞活性明显升高(P<0.01),结果表明ST2-104多肽对于鱼藤酮引起的细胞损伤具有保护作用。Hoechst 33258荧光染色用于评价细胞凋亡,结果显示,与Con组比较,ROT组细胞核呈现碎片样,荧光强度增加;与ROT组比较,ROT+ST2-104组荧光强度降低,细胞形态明显改善。Western Blot实验检测凋亡相关蛋白表达,结果显示,与Con组比较,ROT组中促凋亡蛋白Bax和C-caspase-3表达明显增加(P<0.01,P<0.001),抗凋亡蛋白Bcl-2的表达则相反(P<0.01);与ROT组比较,ROT+ST2-104组中C-caspase-3和Bax蛋白表达明显降低(P<0.05,P<0.01),且Bcl-2蛋白表达明显增加(P<0.05),Hoechst 33258荧光染色和Western Blot实验结果表明ST2-104多肽能够抑制鱼藤酮诱导的神经元凋亡。MDC染色实验用于评价细胞自噬,结果显示,与Con组比较,ROT组中荧光强度明显增强,自噬体数量明显升高;与ROT组比较,ROT+ST2-104组中细胞荧光强度降低,自噬体数量明显减少。Western Blot实验检测自噬相关蛋白表达,结果显示,与Con组比较,ROT组中自噬关键蛋白LC3-II、Beclin-1表达均明显升高(P<0.05,P<0.01);与ROT组比较,ROT+ST2-104组Beclin-1和LC3-II表达均明显下降(P<0.05,P<0.01),MDC染色和Western Blot实验结果表明ST2-104多肽对于鱼藤酮引起的细胞自噬具有抑制作用。应用流式细胞术实验检测胞内钙离子浓度,结果显示,与Con组比较,ROT组细胞荧光强度升高,荧光细胞比例也明显升高,提示胞内钙离子浓度增加;与ROT组比较,ROT+ST2-104组细胞荧光强度以及荧光细胞比例均显著降低,实验结果表明ST2-104多肽明显抑制了鱼藤酮引起的胞内钙超载。为进一步探究在鱼藤酮处理的SH-SY5Y细胞中,凋亡与自噬之间的关系,分别应用自噬激动剂雷帕霉素(RAPA)和自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)进行干预,应用RAPA干预后,与ROT+ST2-104组比较,ROT+ST2-104+RAPA组实验结果出现翻转,细胞凋亡以及细胞自噬水平均明显升高,结果表明自噬激动剂RAPA抑制了ST2-104对鱼藤酮诱导的细胞凋亡的保护作用,提示ST2-104多肽通过减少自噬阻断鱼藤酮诱导的神经元凋亡。应用自噬抑制剂3-MA干预后,与ROT+ST2-104组比较,ROT+ST2-104+3-MA组细胞自噬以及细胞凋亡水平均明显降低,结果表明自噬抑制剂3-MA增强了ST2-104多肽对鱼藤酮诱导的神经元凋亡的抑制作用,进一步提示ST2-104多肽通过减少自噬阻断鱼藤酮诱导的细胞凋亡。为确定ST2-104多肽是否通过CaMKKβ/AMPK/mTOR信号通路抑制鱼藤酮诱导的细胞凋亡,应用CaMKKβ抑制剂STO-609进行干预,结果显示与ROT+ST2-104组比较,ROT+ST2-104+STO-609组细胞凋亡进一步降低,结果表明STO-609增强了ST2-104多肽对鱼藤酮诱导的神经元凋亡的抑制作用;与ROT+ST2-104组比较,ROT+ST2-104+STO-609组自噬水平也进一步下降,结果表明ST2-104多肽通过CaMKKβ抑制鱼藤酮诱导的SH-SY5Y细胞自噬;Western Blot实验检测信号通路相关蛋白表达,结果显示与Con组比较,ROT组CaMKKβ和p-AMPK蛋白表达明显增加(P<0.01),p-mTOR蛋白表达明显降低(P<0.05);与ROT组比较,ROT+ST2-104组CaMKKβ和p-AMPK蛋白表达显著降低(P<0.01),p-mTOR蛋白表达明显增加(P<0.05);与ROT+ST2-104组比较,ROT+ST2-104+STO-609组CaMKKβ和p-AMPK蛋白表达进一步降低(P<0.05,P<0.01),p-mTOR蛋白表达也进一步升高(P<0.05),结果表明ST2-104多肽通过抑制CaMKKβ/AMPK/mTOR信号通路抑制鱼藤酮诱导的神经元中的自噬及凋亡。结论:ST2-104多肽能够抑制鱼藤酮引起的帕金森病神经元凋亡,且其抑制神经元凋亡的机制可能是通过抑制神经元钙超载,从而抑制CaMKKβ/AMPK/mTOR信号通路,减少细胞自噬,最终抑制神经元凋亡。