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细胞凋亡(apoptosis)是细胞在受到生理或病理刺激后发生的自发性的死亡过程。近年研究表明,半胱天冬酶(caspase)家族是细胞凋亡的关键执行者。根据caspase在细胞凋亡中的不同作用,可将其分为3个亚类:ICE(IL-1β converting enzyme)亚类、凋亡起始亚类(initiator)和凋亡效应亚类(effector)。其中凋亡起始亚类包括caspase-2、-8、-9和-10,凋亡效应亚类包括caspase-3、-6和-7。 Caspase-8属于起始caspase,在死亡受体介导的细胞凋亡中,caspase-8处于凋亡信号通路的上游,其活化遵循“诱导接近模式”(induced proximity model),即三聚体化的死亡受体经FADD或TRADD募集caspase-8,形成“死亡诱导的信号复合体”(DISC),使得caspase-8间相互催化并活化。 1997年,Muzio等证实,去除氨基端原结构域的caspase-8可以有效地激活 — — caspase习、J和习。1998年,S灿vasula等构建了大、小亚基次序颠倒的重构型人 caspase上和七,它们具有高效的促凋亡活性。由于c卿ase家族分子在结构上具有相 似性,我们推测,大、小亚基次序颠倒的重构型人caspaseE也应当可以自动折叠成 活性型的二聚体结构,并具有持续的促细胞凋亡活性。 在本研究中,我们用RT干CR的方法从人Jurkat细胞系中克隆了人caspase{ 催化结构域基因。采用重组PCR,构建了两种大、小亚基基因次序颠倒的重构型人 caspaseS基因仰和SLL卜随后,将重构的人caspase8基因克隆入真核表达载体 pllLESZEGFP中,瞬时转染HeLa细胞,研究与EGFP共表达的重构型人caspaseE 的促凋亡活性。另外,我们还研究了去除氨基端原结构域(N中rodomain)的caspaseE (即LS)的促凋亡活性。 我们用Western blot、间接免疫荧光等方法证实了重构型人caspaseS基因的表 达。借助荧光显微镜,我们观察到,与pIRESZ*GFP空载体转染组比较,SL和SLL 实验组被转染细胞在转染后20小时即出现变圆、皱缩。惜助DAPI染色,可明显看 到染色质固缩等典型的细胞凋亡特征。该现象也被免疫细胞化学染色结果及电镜观 察结果所证实。细胞骨架染色结果显示,SL和SLL转染组阳性细胞没有完整的细胞 骨架,细胞极度皱缩。而同批同时转染空载体的HeLa细胞仍有大量的EGFP阳性 细胞贴壁生长,且形态完好;LS转染组仅见有少量的皱缩、固缩细胞。借助倒置显 微镜,我们看到,SL和SLL转染组培养液中可见大量的悬浮细胞,而空载体和LS 转染组细胞仍贴壁生长,状态良好,仅见有少量的悬浮细胞。 因此,我们认为,大、小亚基次序颠倒的重构型人caspase8门SL和SLL) 可以在细胞胞质中自动折叠成活性型的二聚体结构,并具有自发的、持续的促细胞 凋亡活性,可以快速、高效的引发HeLa细胞凋亡,而去除氨基端原结构域的 caspase毛(即LS)即使过表达也不足以诱导HeLa细胞凋亡。