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超声靶向破坏微泡(ultrasound-targeted microbubble destruction,UTMD)是一种新的介导基因转染、药物摄取和载体递送的转移技术,具有靶向性、安全性、有效性和操作简便等优点。本课题组前期研究已证实,UTMD可安全、有效增强腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)体内外转染视网膜色素上皮细胞及组织,同时加快了AAV携带基因的表达。以上结果提示,UTMD不仅促进AAV进入细胞,还可能加快其在细胞内的运输。已有研究发现UTMD通过“声孔效应”促进载体穿过细胞膜进入细胞,但目前尚未见UTMD对细胞内转运影响的相关研究报道。本实验拟利用AAV为载体媒介,针对UTMD作用后细胞内运输行为进行观察和研究,以期进一步探索UTMD的机制,为此技术的拓展及优化应用提供实验基础。 第一章:UTMD介导AAV为载体的基因转染方案优化 目的:优化UTMD参数组合以期实现安全有效促进AAV转染。 方法:携绿色荧光蛋白基因的重组2型AAV(rAAV2-EGFP)以浓度梯度自然转染人宫颈癌细胞HeLa,获得量效曲线。以前期研究UTMD优化参数为依据,选择参数包括超声功率、辐照时间、占空比和微泡体积比,罗列可能的6组参数组合,分别介导rAAV2-EGFP转染HeLa细胞。48h后,采用倒置荧光显微镜观察EGFP表达情况,流式细胞仪测定转染效率。采用CCK-8方法检测细胞活性。 结果:选择rAAV2-EGFP剂量2000v.g./cell用以参数优化实验。UTMD优化参数组合为超声功率1W/cm2、辐照时间60s、占空比1∶5和微泡体积比1∶5。以优化的UTMD介导rAAV2-EGFP转染HeLa细胞,48h后,转染效率自15.39%±0.15%提升至24.97%±0.19%,提高百分率为62.25%。优化的UTMD参数对细胞生存率无显著损害(P=1.000)。 结论:获得的UTMD优化参数可安全、有效提高AAV对HeLa细胞的转染,相应参数可用于下一步机制研究。 第二章:UTMD介导AAV转染内吞受限细胞NIH/3T3 目的:探索UTMD对小鼠成纤维细胞NIH/3T3(AAV转运内吞受限细胞)内AAV转运内吞障碍的影响。 方法:rAAV2-EGFP以浓度梯度自然转染NIH/3T3细胞,获得量效曲线。根据AAV转染HeLa细胞和NIH/3T3细胞的转染效率的高低,分别选择低中高三个剂量,使用优化的UTMD参数,介导不同剂量的AAV转染HeLa细胞和NIH/3T3细胞。48h后,采用倒置荧光显微镜和流式细胞仪观察EGFP表达情况。采用Real-timePCR和WesternBlotting测定EGFPmRNA含量及EGFP蛋白含量。采用CCK-8测定细胞活性。 结果:转染HeLa细胞AAV的低中高剂量分别是1000v.g./cell、2000v.g./cell和4000v.g./cell。当AAV为中剂量(2000v.g./cell)时,UTMD可显著提高AAV对HeLa细胞的转染效率(P=0.002)和单细胞荧光强度(P=0.005),提高百分率分别为60.41%和58.20%;对低剂量及高剂量AAV无明显提高效果。转染NIH/3T3细胞的三个AAV剂量分别是1000v.g./cell、10000v.g./cell和500000v.g./cell。UTMD均可显著提高此三个剂量的AAV对NIH/3T3细胞的转染效率(118%,P=0.002;63.94%,P=0.002;11.65%,P=0.019)和单位细胞平均荧光强度(14.44%,P=0.009;34.37%,P=0.001;15.27%,P=0.025)。Real-timePCR结果显示,UTMD介导AAV为载体的EGFP基因转录在HeLa细胞和NIH/3T3细胞的提高倍数分别为1.62±0.11倍(P=0.001)和1.64±0.28倍(P=0.017)。Westernblotting结果显示,UTMD均能提高AAV携带的EGFP基因在HeLa细胞和NIH/3T3细胞的蛋白表达。优化的UTMD参数和AAV剂量未明显影响细胞活性(P>0.05)。 结论:与内吞正常细胞HeLa相比,UTMD增强AAV转染内吞受限细胞NIH/3T3无剂量限制性,但增强效果有限,提示UTMD有促进细胞内吞的可能性。 第三章:UTMD介导AAV入胞及入核的研究 目的:明确UTMD介导下,AAV病毒颗粒入胞和入核的进程与细胞内吞的关系。 方法:检验UTMD参数和AAV剂量应用于共聚焦皿内HeLa细胞的有效性。采用免疫荧光共聚焦显微镜观察UTMD介导rAAV2-EGFP转染后10min、45min、2h和24h,AAV病毒颗粒在细胞浆和细胞核内的分布和数量。选择AAV在细胞内明显增多的时间点,Real-timePCR检测细胞内所含基因数量以验证UTMD对AAV转运的增强,核浆分离后分别WesternBlotting测定AAV病毒衣壳数量以验证UTMD对AAV入胞和入核的增强。以上实验所设对照组均为自然转染的AAV组。 结果:UTMD显著提升AAV对培养于共聚焦皿玻底的HeLa细胞的转染效率,自16.98%±0.38%提升至27.93%±1.40%(P=0.000)。共聚焦结果显示,UTMD作用后45min和2h,UTMD明显增多AAV进入胞浆的数量;转染后2h,AAV进入胞核的数量明显增多。Real-timePCR结果显示,转染后45min和2h,UTMD均能显著增加AAV入细胞的基因数量(分别是P=0.001和P=0.031),提高倍数分别为1.45±0.08倍和1.46±0.13倍。WesternBlotting结果显示,转染后45min,UTMD显著增多AAV入胞和入核的衣壳蛋白含量;转染后2h,增多不明显。 结论:UTMD增强AAV转运的高峰位于转染后45min,与细胞内吞的高峰时间重叠,提示UTMD有可能促进了细胞内吞。 第四章:UTMD增强AAV转染与细胞内吞的关系 目的:明确UTMD对AAV转染的增强作用与网格蛋白介导的细胞内吞的关系。 方法:UTMD介导AAV转染后45min和2h,免疫荧光共聚焦显微镜观察HeLa细胞浆内网格蛋白的表达和在细胞膜上的聚集,与未处理细胞(control组)、AAV转染细胞(AAV组)和UTMD处理细胞(UTMD组)比较,分析UTMD对网格蛋白表达和聚集的影响。UTMD介导AAV转染后45min和2h,Westernblotting测定HeLa细胞内网格蛋白的含量,与AAV组和UTMD组比较,分析UTMD对网格蛋白表达的影响。UTMD介导AAV转染后45min,透射电镜观察HeLa细胞膜内侧面内吞泡的形态和数量,与control组和AAV组比较,分析UTMD对内吞泡形成的影响。使用氯丙嗪(CPZ)抑制细胞网格蛋白介导的内吞,UTMD介导rAAV2-EGFP转染,48h后,倒置荧光镜观察EGFP表达,流式细胞仪测定转染效率。 结果:免疫荧光共聚焦显示,与AAV自然转染相比,UTMD单独作用后45min和2h,胞浆内网格蛋白荧光强度明显增强,细胞膜上网格蛋白聚集颗粒明显增多;当UTMD联合AAV后,以上增强效果更加明显。WesternBlotting证实,在作用后的45min,与AAV自然转染的细胞相比,单独UTMD及UTMD+AAV作用后细胞内网格蛋白表达水平明显提高。进一步利用透射电镜观察细胞膜内侧面内吞泡,结果显示,在作用后45min,与未处理细胞及AAV自然转染的细胞相比,UTMD+AAV处理的细胞内侧面有包裹的内吞泡及无包裹的内吞泡明显增多。使用CPZ后,AAV组及UTMD+AAV组的转染率均显著下降(分别是5.12%,P=0.001和8.79%,P=0.024),但抑制后的UTMD+AAV组转染率仍高于抑制后的AAV组。 结论:UTMD单独作用可增强细胞内吞泡的形成及对应网格蛋白的聚集,当联合AAV后,此效应更为明显;抑制内吞后尚不能完全阻抑UTMD促进AAV转染的效果。所以,促进内吞是UTMD介导细胞摄取载体的机制之一。