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血友病A是一种X-连锁隐性遗传病，在男性中的发病率约为1-2／10000。血友病A的临床症状主要为自发性关节、软组织或其他组织的出血、血肿，常可致残，甚至危及生命。其致病机制是由于编码凝血因子Ⅷ（简称FⅧ）的基因先天性异常而导致的凝血因子Ⅷ缺乏或功能缺陷。血友病A是基因治疗的首选疾病之一。在血友病A基因治疗的研究中发现，重组的野生型FⅧ在细胞中的表达量较低，其主要原因有：第一，在FⅧcDNA结构中，有一段大约1.2kb的片段对mRNA的积累起抑制作用，相当于一个转录沉寂子或转录延伸阻遏子的作用，从而大大降低了FⅧ的表达水平。第二，FⅧ分子从内质网向高尔基体转移效率低会影响其分泌效率。第三，合成以后的FⅧ分子极其敏感，极易受到蛋白酶的降解，需要与vWF因子结合才能稳定存在。研究表明，改造hFⅧ是提高hFⅧ在细胞中的表达量的一个有效途径。目前，对hFⅧ的改造主要集中在以下几个方面：1，缺失B区。2，去除其5’-UTR和3’-UTR。3，在hFⅧ基因中插入apoA-1内含子。我室已对hFⅧ进行了上述改造，将hFⅧ改造成了hFⅧ-BSP。在本研究中，一方面，为了进一步提高hFⅧ-BSP的翻译效率，将hFⅧ-BSP的ATG侧翼序列改成了Kozak序列；另一方面，为了提高hFⅧ-BSP的分泌效率，对其进行了定点诱变：L303E，F309S，从而将hFⅧ-BSP改造成hFⅧ-SK39。载体选择是目前基因治疗领域面临的主要问题。病毒载体因其体内、外转染效率均较高而成为基因治疗中广泛应用的载体，迄今为止，有70％的临床试验采用病毒载体，但病毒载体仍然存在安全性的问题。我室构建了一种新型的非病毒载体-pHrneo，与其他非病毒载体的最大区别在于，pHrneo具有定点整合能力。我室前期的研究表明，pHrneo能够将外源治疗性基因定点靶入到HT1080（人纤维肉瘤细胞）的核糖体基因区。在本研究中，首先，将hFⅧ-BSP改造成hFⅧ-SK39，采用电转染术将hFⅧ-BSP和hFⅧ-SK39的表达载体pcDBSP和pcDSK39分别转染HT1080细胞，经过G418筛选和PCR鉴定，获得阳性单克隆细胞；采用ELISA的方法检测hFⅧ-BSP和hFⅧ-SK39在HT1080细胞中的表达水平。然后，我们构建了携带有hFⅧ-SK39的核糖体基因区靶向表达载体：pHrneo-SK39。接下来，采用电转染术将pHrneo-SK39转染到HL7702（人肝细胞）中，经过G418筛选和PCR鉴定，获得定点整合细胞。然后，采用ELISA、Western blotting和一期法检测了定点整合细胞中hFⅧ-SK39表达情况，还检测了定点整合细胞的生长状况指标。在对其中一个定点整合细胞克隆进行连续传代50次的过程中，监测了hFⅧ-SK39的表达情况。最后，我们采用高水压注射法将pHrneo-SK39直接通过尾静脉注射到裸鼠体内，采用ELISA法检测了裸鼠中hFⅧ-SK39的表达情况，并进行了转氨酶、总胆红素的检测和肝组织的病理学检查。结果显示：1，hFⅧ-BSP改造成hFⅧ-SK39在HT1080细胞中的表达量分别为2.99±0.28 ng／106细胞／天和9.90±1.89 ng／106细胞／天，相比之下，hFⅧ-SK39具有表达优势。2，pHrneo-SK39将hFⅧ-SK39成功地靶入到HL7702细胞中的核糖体基因区，定点整合效率为1.1×10-5。3，定点整合细胞中hFⅧ-SK39的表达量为4.3±0.9 ng／106细胞／天。而且定点整合细胞的生长状况没有发生改变。4，定点整合细胞能稳定表达hFⅧ-SK39。5，pHrneo-SK39能在裸鼠中进行有效表达，受试鼠中hFⅧ-SK39的最高浓度为4.56ng／ml。通过本课题的研究，我们积累了较为系统的关于pHrneo-SK39的实验数据，为将pHrneo-SK39应用到血友病A的基因治疗奠定了重要的研究基础。