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研究背景和目的胆管癌是起源于肝脏胆道系统衬覆上皮的恶性肿瘤,在所有肝脏原发肿瘤中,其发生率占10%-15%,并且发病率有逐年增加趋势。胆管癌恶性程度较高,发现较晚,预后差,统计显示术后五年存活率仅30%-40%,不能手术患者中位生存期仅12-15个月。另外,全球来看,东亚和南亚是胆管癌高发地区。因此,对于其发生发展机制探索显得尤为重要。从1998年被日本研究者发现到现在,人们对RMP（RNA polymerase II subunit5-mediating protein,亦被称作URI,Unconventional prefoldin RPB5 Interactor）认识越加深入。mTOR能够磷酸化RMP,抑制相关基因的表达,协助酵母菌和细胞克服恶劣营养环境而存活。卵巢癌中,RMP与PP1γ结合形成复合体并抑制其磷酸酶活性,从而破坏后者与S6K1-BAD组成的负反馈通路,增加BAD磷酸化,减少细胞凋亡,促进存活。此外,RMP在前列腺癌、胃癌、结直肠癌等各类恶性肿瘤中也被报道发挥促肿瘤作用。本课题组也对RMP在肝癌中的作用进行了探索,发现RMP能易化p65与IL-6启动子区结合,促进其转录,使肝癌细胞产生更多IL-6,通过IL-6/STAT3信号通路,促进肝癌转移和自我更新。而RMP在胆管癌中作用机制的研究少有报道,亟待进一步研究和探索。内外环境因素变化对于肿瘤生长具有重要作用。一方面,ROS（Reactive Oxygen Species）引起的细胞基因突变是肿瘤发生的重要原因,另一方面,ROS大量产生和释放,会引起细胞内氧化还原平衡状态打破,导致一系列诸如DNA损伤、细胞膜结构破坏、细胞器破坏等现象,最终导致细胞凋亡的发生。近些年有研究指出,在肿瘤发生过程中,ROS的产生是被抑制的。因此,探索肿瘤发生发展过程中ROS的作用机制,具有非常重要的意义。KEAP1-NRF2-ARE信号通路在细胞抗氧化过程中起重要作用。KEAP1（Kelch-like ECH-associated protein 1）为E3泛素连接酶CUL3提供支架,而后者能够通过泛素-蛋白酶体介导NRF2降解,使NRF2仅维持较低水平,以保证日常生命活动。氧化应激时,上游相关刺激介导NRF2降解终止并入核,促进抗氧化相关基因的转录,参与细胞抗氧化相关生理活动。本课题拟利用前期构建的过表达或干扰RMP的慢病毒,建立多种差异表达RMP细胞系,并利用课题组所建立小鼠自发胆管癌模型、小鼠荷瘤模型、尾静脉注射肺转移模型,结合临床胆管癌样本,全面深入研究RMP对胆管癌细胞恶性生物学行为和氧化应激过程的调控,进一步阐明其参与信号传导过程,验证其作为胆管癌干预靶点的价值及改善肿瘤化疗耐药的作用。研究方法1、利用慢病毒建立稳定传代差异表达RMP胆管癌细胞系。2、CCK8增殖试验、Transwell迁移试验、平板克隆试验、软琼脂克隆试验观察差异表达RMP胆管癌细胞生物学行为。3、构建裸鼠皮下荷瘤、尾静脉注射肺转移模型,在体内观察差异表达RMP胆管癌细胞肿瘤形成、生长和转移能力。4、实时定量PCR和蛋白电泳分别从转录和翻译水平检测抗氧化相关基因表达变化。5、检测差异表达RMP细胞、肿瘤组织中GSSG和GSH含量。6、荧光素酶报告基因系统观察RMP高低表达背景对抗氧化反应元件的转录活性影响。7、流式细胞术检测RMP对于ROS和细胞凋亡的影响。8、构建RMP和KEAP1全长和不同功能结构域的截短体质粒以及RMP突变体质粒。9、免疫共沉淀技术观察KEAP1蛋白与NRF2、RMP蛋白相互作用,明确三者关系及相互作用位点。10、免疫荧光技术观察KEAP1和RMP以及NRF2蛋白在细胞中的定位。11、结晶紫染色检测差异表达RMP细胞化疗药物奥沙利铂浓度—生长曲线。12、观察奥沙利铂对差异表达RMP细胞裸鼠皮下荷瘤模型肿瘤生长影响。13、构建肝细胞特异性RMP敲除小鼠,并与PTENflox/+;KrasG12D;Alb-Cre自发胆管癌模型杂交繁育PTENflox/flox;RMPflox/flox;KrasG12D;Alb-Cre小鼠,比较RMP敲除对于小鼠肝内胆管癌发生和进展的影响。14、分离并建立稳定传代AKPP和AKPPRR小鼠胆管癌原代细胞,比较抗氧化相关信号通路差异。15、免疫组织化学技术检测RMP、抗氧化、增殖、损伤等标志蛋白在肿瘤组织中表达。16、临床肝内胆管癌样本分析RMP与临床相关特征、总生存期、无瘤生存期的关系。17、肝内胆管癌PDX样本观察RMP表达高低对肿瘤生长影响。研究结果1、使用3’和5’双向探针经Southern blotting证明loxp序列准确地插入小鼠RMP基因Exon3两端,将RMPflox与Alb-Cre小鼠杂合以实现肝脏特异性RMP敲除。2、在AKPP自发胆管癌小鼠模型基础上敲除RMP,减缓胆管癌的发生、发展过程。3、RMP促进胆管癌细胞锚定非依赖生长。4、RMP能够增强胆管癌细胞氧化应激耐受能力,提高细胞凋亡抵抗力。5、RMP影响胆管癌细胞和肿瘤组织抗氧化能力是通过调节NRF2蛋白水平表达来实现,而RMP对NRF2转录水平表达无影响。6、胆管癌细胞干扰RMP背景下,NRF2蛋白降解速率加快;而过表达RMP后,NRF2蛋白稳定性增加。7、RMP通过其蛋白分子中D2区域竞争性结合KEAP1蛋白分子中Kelch区域,减少NRF2蛋白降解,增加其稳定性。8、RMP表达增加,提高胆管癌细胞对于奥沙利铂耐药性。9、RMP高表达肝内胆管癌患者总生存期和无病生存期均较RMP低表达患者短,预后相对差。10、肝内胆管癌组织中RMP与NRF2表达正相关,并且两者均高表达患者预后差。11、肝内胆管癌PDX样本中RMP高低表达影响肿瘤生长速度。12、差异表达RMP肝内胆管癌PDX原代细胞具有不同的抗氧化能力。结论本研究发现癌基因RMP增强胆管癌细胞抗氧化能力,抵抗细胞凋亡,促进锚定非依赖生长,增强肿瘤细胞对于奥沙利铂化疗抵抗;在小鼠自发胆管癌模型中,敲除RMP抑制肿瘤发生、发展;RMP促进胆管癌细胞裸鼠皮下生长、肺转移等过程;在肝内胆管癌患者队列中,RMP与NRF2表达相关,并且RMP和NRF2高表达患者预后相对差。本研究证明上述现象通过以下分子机制实现:RMP通过其蛋白分子中D2区域竞争性结合KEAP1蛋白分子中Kelch区域,减少NRF2蛋白降解,增加其稳定性,从而促进下游相关抗氧化分子表达,提高细胞抗氧化能力。本研究进一步拓宽RMP在肿瘤发生、发展过程中发挥作用方式,阐述RMP在胆管癌抗氧化过程中重要作用,为针对性提高化疗药物治疗效果、改善耐药提供方向。