CRISPR/Cas9系统是一种从细菌抵抗外源DNA入侵的机制中新开发出来的基因定点编辑工具,其因具有构建简单、适用范围广、效率高、成本低等特点而备受广大基因工程从业者的喜爱,并且在医学和动植物育种等多个领域已获得较为成功的应用。RBM10(RNA binding motif protein 10)基因是RBM基因家族的成员之一,其位于X染色体上且翻译产物参与了细胞凋亡相关调控。研究表明该基因突变可能与某些疾病或癌症有关。本研究拟通过单细胞PCR技术在小鼠受精卵内筛选出一对能够高效删除RBM10基因的Cas9靶位点,为快速获得该基因突变或敲除的疾病动物模型提供参考。单细胞PCR作为一种只需要将单个细胞内所包含的遗传物质作为模板即可进行扩增的技术,如何获取单个细胞内的遗传物质并将其制备成高质量的模板是影响整个反应的成功与否的关键所在。本研究首先利用三种不同蛋白酶K细胞裂解液(SDS细胞裂解液、NP-40细胞裂解液、Tween-20细胞裂解液)分别对体外培养成熟的单个猪卵母细胞进行裂解,并将裂解产物直接作为模板进行巢式PCR扩增,最终结果显示:NP-40细胞裂解液制备的模板质量最好,其扩增效率为91%;其次为Tween-20细胞裂解液,其扩增效率为61%;SDS细胞裂解液产物中未检测到阳性条带。通过检索NCBI的基因库,获得了小鼠RBM10基因相关序列,利用Zifit软件对其进行Cas9靶位点预测,并成功构建出了相应靶位点gRNA的表达质粒载体。以载体质粒为模板进行PCR反应扩增出sgRNA体外转录模板。利用T7体外转录试剂盒进行体外转录获得相应靶位点gRNA,并将Cas9 m RNA及纯化后的靶位点gRNA进行混合稀释,最终将Cas9 mRNA的浓度调至200ng/μL,靶位点gRNA的浓度为30ng/μL,然后通过显微注射的方式将其注入小鼠受精卵的胞质内。通过前期构建的单细胞双重PCR检测方法对早期胚胎进行删除效率的检测,结果显示:扩增效果良好,并有大量疑似阳性的扩增片段(100~200bp)。对疑似阳性的片段进行测序分析,结果表明:成功实现了小鼠RBM10基因在T1、T2两个靶位点间约2100bp的DNA长片段删除,经统计学分析,其删除率约为81.9%,且暂未出现脱靶现象。