研究背景和目的鼻咽癌是常见的恶性肿瘤之一,80%发生在中国。鼻咽痛由于解剖位置特殊,放射治疗是其主要治疗手段。近年来随着诊断技术的发展,放疗技术的不断改进及各种有效治疗手段的应用,疗效进一步提高,但5年生存率仍徘徊在70-80%左右。放射治疗是鼻咽癌的主要治疗手段,若在放射线杀灭痛细胞同时应用基因治疗提高鼻咽痛细胞的放射敏感性,有可能获得更好的疗效。近年来,随着分子生物学,肿瘤免疫学等领域的进步和发展,相关基因的克隆及表达成功,使肿瘤的基因治疗成为可能,并有望成为继手术、放疗、化疗及免疫治疗后又一重要的治疗手段。众多的基因治疗中,针对自杀基因的治疗最引人瞩目,但临床疗效并不令人满意。近年来有学者尝试利用放射线来实现对转移基因体内表达的时空调控,能提高基因靶向表达的效率,同时发现基因治疗还可以提高肿瘤对放射线的敏感性,取得了令人鼓舞的效果。RNA干扰（RNA interference,RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（doubl e-stranded RNA,dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。近几年来RNAi研究取得了突破性进展,被《Science》杂志评为2001年的十大科学进展之一,并名列2002年十大科学进展之首。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达,所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。RNAi作为一种高效的序列特异性基因剔除技术在传染性疾病和恶性肿瘤基因治疗领域发展极为迅速。原痛基因Pokemon（zbtb7基因）位于人类染色体19p13.3区域,全长21600bP。Pokemon基因mRNA长4456bp,该基因由2个外显子构成,其中含有个开放的阅读框,编码含584个氨基酸残基的Pokemon蛋白,分子量为61.5kD。研究表明,Pokemon可能是通过抑制抑癌基因ARF的转录来发挥致痛作用,通过Pokemon↑→ARF↓→MDM2↑→p53↓→肿瘤发生这一致痛模式而发挥促进肿瘤生长的作用。目前发现原痛基因Pokemon在一些人类肿瘤如淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌和膀胱痛等肿瘤中1存在高表达。在鼻咽癌细胞,Pokemon基因也存在高表达。野生型P53作为Pokemon基因的效应基因,当基因组的DNA受到损害时,参与受损DNA的修复；如果修复失败,野生型P53将会启动细胞程序性死亡过程,诱导细胞凋亡。研究表明：将野生型p53基因导入肿瘤细胞后能够抑制肿瘤细胞的生长,增加肿瘤细胞的凋亡率。Pokemon基因是一种新的似乎控制着细胞突变的整个过程对癌症形成至关重要的痛基因,它是其他痛基因引发癌症所必须的,此前发现的致癌基因都不具备类似功能。腺病毒、慢病毒载体及原核表达和真核表达系统,常用于特定基因的产物表达。在实验和临床治疗中经常使用的的病毒载体有腺病毒载体、逆转录病毒载体、腺相关病毒载体等,其中由于腺病毒载体转染效率高、插入外源基因片段大、CMV启动的宿主范围广、高病毒滴度、易浓缩贮存、介导外源基因短时呈高水平表达以及不整合到感染细胞的基因组中等优点,使得腺病毒载体成为目前基因治疗研究和临床试验中应用最为广泛的病毒载体之一目前所采用的病毒载体如腺病毒载体,利用高效的基因转移载体系统,可以有效地将基因治疗和放射治疗结合起来,发挥协同效应,是肿瘤基因治疗的重要方向之一。腺病毒是一种双链DNA病毒,正常寄生于人体上呼吸道,一般不会引起人体疾病,也无致瘤性报道。腺病毒的不整合、不致瘤性使其具有较好的安全性。基因治疗时载体基因组上的E1A和E1B基因已被目的基因所取代,因而在普通细胞内缺乏复制能力；只有在染色体己整合有E1A和E1B的包装细胞（如293细胞）中,复制能力缺陷型的重组腺病毒才能包装成完整的腺病毒颗粒。腺病毒对实体瘤细胞有很高的感染能力,如肝癌、肺癌、鼻咽癌等。因此,本项目通过采用对Pokemon进行基因沉默的RNAi（RNA interference,RNA干扰）技术,将沉默Pokemon基因的siRNA片段及野生型p53基因重组入缺陷型腺病毒中,构建出重组腺病毒后,将感染重组腺病毒的鼻咽癌细胞CNE-2进行放射治疗,分别从mRNA和蛋白质水平进行检测治疗前后Pokemon、p53、P14ARF基因的表达情况,流式细胞仪分析细胞凋亡情况,分析其是否能提高鼻咽癌对放射治疗的敏感性。方法1.鼻咽癌细胞株的培养CNE-2细胞常规培养于含10%胎牛血清的1640培养液中,培养箱条件：5%C02、37℃恒温。按常规条件消化传代。2.靶向Pokemon基因的siRNA片段合成根据NCBI GenBank上公布的Pokemon基因（NM015898）全长序列,遵循siRNA的设计原则,利用在线软件筛选出3条序列交由广州市锐博生物科技有限公司合成,所选择的序列通过BLAST在GenBank上比对,证明所选择的序列与其他基因没有同源性。实验同时以GACATCATAGGTCGCATGC作为阴性对照组的干扰序列,此序列不与任何人类基因序列同源。3.siRNA片段转染取对数生长期的细胞,接种于6孔板及96孔板内,待细胞达到85%-90%的融合时,按照LIPOFECTAMINE RNAIMAX试剂盒操作步骤及试剂配制比例,加入转染试剂及siRNA片段,4小时后加入新鲜培养液。4.Pokemon基因表达的检测应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测Pokemon基因RNA的表达。收集转染后24h的CNE一2细胞用TRIzol法提取总RNA。取扩增后的产物5u L进行2%的琼脂糖凝胶电泳。采用免疫印迹法（Western blot）检测Pokemon蛋白的表达。收集转染后24h的CNE-2细胞,用细胞裂解液抽提细胞总蛋白,Bradford法检测总蛋白浓度,取50μ g总蛋白进行电泳。然后在KODAK IMAGE STATION2000R成像仪上进行拍照,利用SensiAnsys图像分析软件分析电泳条带的灰度值,检测Pokemon基因及蛋白的表达强度。5. P14ARF、p53基因表达的检测应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测P14ARF、p53基因RNA的表达。收集转染后24h的CNE-2细胞用TRIzol法提取总RNA。取扩增后的产物5u L进行2%的琼脂糖凝胶电泳。采用免疫印迹法（Western blot）检测Pokemon蛋白的表达。收集转染后24h的CNE-2细胞,用细胞裂解液抽提细胞总蛋白,Bradford法检测总蛋白浓度,取50μ g总蛋白进行电泳。然后在KODAK IMAGE STATION2000R成像仪上进行拍照,利用SensiAnsys图像分析软件分析电泳条带的灰度值,检测P14ARF、P53基因及蛋白的表达强度。6.细胞增殖活性的检测采用噻唑蓝（MTT）法检测细胞的增殖活性。将转染处理组及空白对照组中处于对数生长期的细胞以3000个／孔接种96孔板,分别于6、12、24、48及72h分别弃去培养基,每孔加入5g/L的MTT溶液继续培养4h,弃去MTT,各孔中加入150u L的DMSO,室温下震荡10min,在酶标仪A490nm处测定各孔的吸光度值（A值）,绘制细胞的生长曲线,并计算细胞的生长抑制率。7.平板克隆形成实验经胰酶消化后,使用6孔板,每孔种入200个细胞,使用完全培养基中培养10天,待显著的细胞集落形成时使用多聚甲醛固定、结晶紫染色,显微镜下计数含>50个细胞的细胞克隆数。8.Transwell迁移实验经胰酶消化后,以无血清培养基洗涤细胞,制作细胞悬液,加入200u1至transwell小室上腔,transwell小室下腔加入600u1培养基,12小时后洗涤,多聚甲醛固定、结晶紫染色液染色,显微镜下计数穿膜细胞数。9.细胞凋亡的检测采用流式细胞术检测细胞的凋亡。收集对数生长期CNE-2细胞1×106,按照试剂盒步骤1000rpm离心10分钟,加入预冷PBS洗涤3次,将细胞重悬于200μL的Binding Buffer,加入10μL Annexin V-FITC,混匀,避光室温反应15min,上机前5min加入10μ L碘化吡啶,再加入300u L的Binding Buffer,1h内上机检测。以各组中凋亡细胞占总计数细胞的百分比计算凋亡率。10.Pokemon基因重组腺病毒的构建与鉴定①重组质粒pAdTrack-CMV-Pokemon的构建合成pre-Pokemon转录模板正义链和反义链的DNA Oligo序列,退火形成DNA双链后与pAdTrack载体同时进行Kpn Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切,连接以构建载体pAdTrack-CMV-Pokemon。②重组腺病毒质粒pAd-Pokemon的构建将经鉴定序列正确的含有GFP（绿色荧光蛋自）标记的pAdTrack-CMV-Pokemon质粒Kpn Ⅰ酶切线性化后,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1电穿孔发共转化。经鉴定正确的克隆命名为pAd-si-Pokemon。制备腺病毒空载体作为阴性对照组。③腺病毒的包装与滴度测定取5μg重组质粒使用LIPOFECTAMINE RNAIMAX （Invitrogene）的方法转染到293A细胞中进行病毒包装。经扩增、纯化后使用病毒噬斑形成实验测定病毒滴度。④重组腺病毒蛋白表达鉴定纯化后的病毒以MOI （multiplicity of infection）为10感染293A细胞,感染48h,细胞按Trizol法提取RNA,逆转录后用引物进行PCR扩增。使用免疫荧光和Western Blotting法检测上清中Pokemon蛋白的表达。11.体外功能实验①细胞增殖活性的检测采用MTT（噻唑蓝）法检测CNE-2细胞的增殖活性。将处于对数生长期的转染组及对照组细胞接种96孔板（3000个/孔）,选取6h、12h、24h、48h及72h时间点弃去培养基,每孔加入MTT溶液（5g/L）继续培养4h,弃去MTT溶液,每孔加入DMSO溶液150u L,室温下震荡10分钟,酶标仪A490nm处测定每孔的吸光度光度值（A值）,然后绘制CNE-2细胞生长曲线图。②平板克隆形成实验经胰酶消化后,使用6孔板,每孔种入200个细胞,使用完全培养基中培养10天,待显著的细胞集落形成时使用多聚甲醛固定、结晶紫染色,显微镜下计数含>50个细胞的细胞克隆数。③细胞凋亡状态的检测利用流式细胞术检测凋亡检测CNE-2细胞的凋亡状态。④Transwell迁移实验经胰酶消化后,以无血清培养基洗涤细胞,制作细胞悬液,加入200u1至tr-nswell小室上腔,transwell小室下腔加入600u1培养基,12小时后洗涤,多聚甲醛固定、结晶紫染色液染色,显微镜下计数穿膜细胞数。12.克隆形成法检测CNE-2细胞的放射敏感性取对数生长期CNE-2细胞,用胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液,计数后用梯度稀释至所需浓度：1×101、1×102、2×103、1×104、1×105、1×106个细胞分别接种于60mm培养皿中,分别使用0、2、4、6、8、10Gy的剂量照射,采用西门子直线加速器照射（6MV X线,射野大小20cm×20cm,SSD=100cm,机架角180度,下垫1.5cm等效膜）,每个照射剂量均设3个平行样品。然后将培养皿在37℃.5％C02的培养箱中培养2周。2周后将各组CNE-2细胞用95%乙醇固定,Giemsa染色后计数（>50个细胞计数为一个存活集落）,计算存活分数（surviving fraction, SF）和克隆形成率。应用单击多靶数学模型（single-hit multitarget model）计算D0值（平均致死剂量）和Dq值（准域剂量）。使用GraphPad Prism4.0软件拟合细胞存活曲线。统计学处理采用SPSS13.0统计软件包进行统计学处理,P<0.05认为差异有统计学意义。所得数据结果用均数±标准差（x±s）表示,多组的组间比较应用单因素方差分析（One-Way ANOVA）,方差不齐时使用Welch校正,在差异显著地前提下进行多重比较,方差齐时采用LSD法,方差不齐时采用Dunnett’T3法。pAd-si-Pokemon腺病毒后Pomemon基因及蛋白的表达的两样本均数使用配对t检验。MTT结果使用析因设计资料的方差分析。结果1.设计的三条siRNA序列转染CNE-2细胞后,PCR产物电泳带结果显示各组的抑制率分别为Si-h-ZBTB7A₀01组为47.51%, Si-h-ZBTB7A₀02组为74.88%,Si-h-ZBTB7A₀03组为44.52%,与阴性对照组和正常组相比,表达抑制率差异有显著意义。Western blot产物电泳带结果显示各组的抑制率分别为Si-h-ZBTB7A₀01组为40.08%, Si-h-ZBTB7A₀02组为72.36%,Si-h-ZBTB7A₀03组为34.64%,与阴性对照组和正常组相比,表达抑制率差异有显著意义。三组比较,Si-h-ZBTB7A₀02组较其他两组抑制效果更好（p<0.05）。2.转染Si-h-ZBTB7A₀02组siRNA后,P14ARF基因的表达较阴性对照组和空白组表达升高（P<0.05）,P14ARF蛋白的表达较阴性对照组和空白组表达升高（P<0.05）；P53基因的表达较阴性对照组和空白组表达升高（P<0.05）,P53蛋白的表达较阴性对照组和空白组表达升高（P<0.05）。3.转染Si-h-ZBTB7A₀02组siRNA后对鼻咽痛CNE-2细胞的生物学功能的影响。MTT法所测的CNE-2细胞干扰前后生长曲线显示RNAi后细胞增殖速度减慢,细胞生长受到抑制（P<0.05）；平板克隆实验显示,RNAi后CNE-2细胞形成的细胞克隆数（47.33±1.15）显著小于阴性对照组（83.67±1.15）和正常组（84.33±1.53）；铺板12小时后,CNE-2细胞穿透基质胶的细胞数（36.33士1.53）较阴性对照组（94.67士2.52）和正常组（94.33士3.51）显著减少。流式细胞术检测细胞的凋亡,RNAi后CNE-2细胞凋亡率（23.533士0.016%）较阴性对照组（9.187士0.002%）和正常组（9.227±0.003%）显著升高。4.构建的重组腺病毒质粒pAd-Pokemon经扩增、纯化后病毒滴度可达4.6×1012VP/ml。经RT-PCR可以扩增出与目的基因大小一致的片段。超滤浓缩的细胞上清经电泳转印显色后显示,接种重组腺病毒pAd-Pokemon的293细胞上清在1371bp左右有一条显著的条带,与预期分泌性的Pokemon基因大小一致。5.感染腺病毒pAd-Pokemon、 pAd-53后对鼻咽癌CNE-2细胞的生物学功能的影响。MTT法所测的CNE-2细胞干扰前后生长曲线显示RNAi后细胞增殖速度减慢,细胞生长受到抑制(P<0.05=, PAd-p53组的CNE-2细胞抑制率较pAd-si-Pokemon组更高（P<0.05=：平板克隆实验显示,pAd-si-Pokemon组（54.00±2.65）、pAd-p53组（40.33士1.53）细胞形成的平板克隆数显著少于对照组（83.33土2.08）（p<0.[）01）,而pDNA-p53组得克隆形成数又少于pAd-si-Pokemon组。铺板12小时后,pAd-si-Pokemon组（45.00±1.00）、 pAd-p53组（33.00士2.64）CNE-2细胞穿透基质胶的细胞数较对照组（82.67士1.53）显著减少（P<0.001）。pAd-p53组穿透基质胶的细胞数又显著少于pAd-si-Pokemon组。流式细胞术检测细胞的凋亡,pAd-si-Pokemon组CNE一2细胞凋亡率（22.6士0.005%）,pAd-p53组CNE-2细胞凋亡率（35.6士0.008%）,较阴性对照组（9.2士0.003%）显著升高。pAd-p53组的CNE-2细胞凋亡率较pAd-si-Pokemon组更高（P<0.05）。6.鼻咽痛CNE-2细胞经腺病毒pAd-Pokemon、pAd-53感染前后前后D0值分别为：1.989士0.017、2.309±-0.477；Dq值分别2.363士0.047、2.773士0.031。pAd-Pokemon组和pAd-53组的放射增敏比SER值分别为1.25、1.16。结论1.本研究所设计合成的Pokemon基因的siRNA可以有效、特异地阻断Pokemon基因的表达；阻断Pokemon基因可以阻止细胞增殖；抑制肿瘤迁移；诱导肿瘤细胞凋亡。2.本研究通过对pAd-Pokemon的重组腺病毒进行包装与扩增、纯化与鉴定,制备了高纯度、高滴度的含pAd-Pokemon的重组腺病毒。3.携带pAd-Pokemon的重组腺病毒感染CNE-2细胞后可以阻止细胞增殖,抑制肿瘤细胞迁移,诱导凋亡增加。4.携带pAd-Pokemon的重组腺病毒感染CNE-2细胞后可以增加CNE-2细胞放射敏感性,与单纯导入p53相比,增敏的效果更显著。