论文部分内容阅读
目的:体外获得CREG基因过表达修饰BMSCs，将其诱导分化为携带CREG基因的RGCs，客观评价过表达CREG基因细胞的抗凋亡能力，为BMSCs移植治疗视网膜退行性变及视神经损伤疾病提供实验依据。 方法:(1)体外分离培养大鼠BMSCs，经流式细胞术鉴定得到稳定的BMSCs。(2)构建CREG基因过表达的腺病毒载体(Ad-CREG)转染BMSCs，得到CREG基因过表达修饰的BMSCs(BMSCs-Ad-CREG)。荧光显微镜观察明确感染复数及CREG在BMSCs中的表达效率;Western blot检测CREG基因表达量。(3)构建细胞缺血缺氧模型，western blot检测caspase-3和caspase-8的表达量，客观评价携带有CREG基因的BMSCs抗凋亡能力是否增强。(4)建立稳定表达CREG的BMSCs模型的基础上，取第3代携带CREG基因的BMSCs，加入乳鼠视网膜细胞条件分化液向RGCs方向神经诱导。通过细胞免疫化学染色及免疫荧光（诱导后的细胞NSE、nestin等神经细胞表面标志物染色阳性）鉴定BMSCs诱导分化效果。(5)建立CREG转染、诱导分化为RGCs细胞系作为实验组;同条件下建立无CREG转染的细胞系作为对照组。Western blot检测两组细胞caspase-3和caspase-8表达量，评价携带CREG基因的RGCs抗凋亡能力是否增强。 结果:(1)体外分离培养的BMSCs能够稳定传代，经流式细胞仪检测细胞表面标志物CD90、CD44表达阳性，CD11b和CD45表达阴性，证明体外培养的细胞是BMSCs;(2)当病毒MOI=10时，荧光表达量相对最多。因此选择MOI=10作为进一步实验的感染复数;瞬时转染Ad-GFP的BMSCs中GFP（绿色荧光蛋白）表达量达到90％; Western blot检测CREG基因在CREG-Ad-BMSCs中的表达量升高(p＜0.05)，所构建的载体成功将目的基因CREG转染BMSCs。(3)经缺血缺氧模型培养后，与阴性对照组相比，CREG-Ad-BMSCs组caspase-3、caspase-8表达量降低。(4)细胞免疫化学染色及免疫荧光结果表明诱导后的细胞NSE、nestin、Thy1.1等染色阳性，BMSCs分化成为RGCs。(5) Western blot检测与对照组相比，实验组caspase-3、caspase-8表达显著下调(p＜0.05)。 结论:(1)本研究分离培养出大鼠BMSCs，将携带有目的基因CREG的腺病毒载体成功转染BMSCs，转染后的BMSCs能稳定表达CREG蛋白。(2)本研究成功将携带有CREG基因的大鼠BMSCs诱导分化为了RGCs细胞(CREG-BMSCs-RGCs)。过表达CREG基因的BMSCs及RGCS能够抑制细胞凋亡。