疼痛是人体各部分受到损伤性刺激引起的不愉快的感觉,它提供躯体受到威胁的警报信号,是生命不可缺少的一种特殊保护功能。但另一方面,严重的慢性疼痛困扰着数以百万计的人们,是临床的一大难题。因而了解疼痛产生的机制,寻找解除疼痛的方法,是医学领域亟待解决的问题。临床观察早就注意到疼痛有明显的性别差异,主要表现在两个方面：1)肠激惹综合征、间质性膀胱炎、颞下颌关节炎等病症多见于女性：2)这些疾病症发生和发展与月经周期相关。这些证据表明性激素可能参与痛觉的调节。 雌激素是一种脂溶性激素,它可以通过激活靶细胞核内受体(即ERα和ERβ),影响靶基因转录。这种作用往往牵涉到新蛋白的合成,需要较长的潜伏期,称为激素的基因组作用。另一方面,雌激素还可以作用于可能存在于细胞膜上的受体,介导快速效应,称为激素的非基因组作用。有证据表明,雌激素细胞膜上的“受体”与核受体(ERα和ERβ)在配体的结合特点上具有相似性,识别核受体的抗体也与细胞膜上的蛋白结合,提示核受体与“膜受体”可能具有同源性。目前已发现,ERα和ERβ广泛分布于DRG初级传入神经元和外周组织细胞,提示雌激素可能影响感觉信号在传入神经末梢的转导过程。 ATP不仅是一种贮能、供能物质,还是一种细胞间信息传递物质,通过激活P2X(配基门控性非选择性阳离子通道)和P2Y(G-蛋白耦联)受体而产生广泛的生物学效应。大量的研究证明,ATP参与痛觉的信号转导与传递,表现在以下几个方面：1)伤害性刺激可以使组织细胞释放ATP;2)外源性ATP可通过激活P2X受体而引起痛觉；3)P2X受体广泛分布于感觉神经末梢和有关中枢传导通路；4)在P2X2和P2X3基因敲除小鼠,炎症性躯体痛觉明显低于对照小鼠,表明ATP是炎症性痛觉的重要介质。背根神经节(DRG)的初级感觉传入神经元是研究痛觉信号转导机制的重要模型之一。在急性分离和培养的DRG细胞上,P2X3受体特异性地参与痛觉的信号转导。而炎症条件下ATP通过P2X3受体在内脏机械性感觉信号转导和内脏感觉过敏中也起到起重要的作用。近年来的研究还发现,除了P2X受体(主要是P2X3受体)外,ATP参与痛觉的转导和传递可能还有P2Y受体的参与。鞘内注射UTP或UDP,可以显著提高机械性伤害感受的阈值,而初级感觉传入神经元胞体上存在多种P2Y受体,都说明P2Y受体可能和P2X3受体一起,成为外周痛觉信号转导和传递中的重要成员。 因而在本课题中,作者运用全细胞膜片钳、分子生物学及免疫组织化学等方法,从整体、细胞和受体分子水平研究雌激素对ATP介导的外周痛觉信号转导的调节作用。重点探讨正常和致炎条件下雌激素对初级感觉传入神经元上P2X3受体的表达与功能以及对P2Y1受体表达的影响,对于阐明疼痛的性别相关性,以及将来研制新一代的镇痛剂,具有重要的意义。 实验模型和方法： 1.大鼠去性腺切除术 30只雌性大鼠随机分成3组,假手术组、去卵巢组和雌激素替代组,每组10只。30只雄性大鼠也随机分成3组,假手术组、去睾丸组和雌激素替代组,每组10只。 2.大鼠结肠炎模型 雌性大鼠40只,分为4组,假手术组,假手术结肠炎组,去卵巢组和去卵巢+结肠炎组。假手术组和去卵巢术组方法同上(方法1),大鼠结肠致炎方法如下：乙醚麻醉,俯卧位,经肛门插入导管约6-8cm,缓缓注入30％TNBS(溶于乙醇,按80mg/kg体重),5-7天后用于实验。对照组经肛门注入等量生理盐水。大鼠去卵巢+结肠炎模型,则在去卵巢后6周前5-7天时,行大鼠结肠致炎。 雄性大鼠20只,分为2组,对照组和结肠炎组。 3.痛阈测定 分别用甩尾热痛仪和热痛刺激仪进行热痛阈测定。用弗莱毛(Von Frey Hair)进行机械性痛阈测定。 4.大鼠DRGP2X3、P2Y1及TRPV1受体mRNA实时定量PCR技术 (1)RNA分离和cDNA合成 大鼠断头致死后,迅速取出8对腰骶段DRG(L1-S2),用Trizol提取液提取总RNA,紫外分光光度计测RNA纯度(A260/280),同时行RNA定量。提取的RNA中,每样本取2μg在20μl体系中反转录成cDNA,-20℃保存,用于实时定量聚合酶联反应扩增P2X3、P2Y1及TRPV1基因。 (2)实时定量RT-PCR 用于扩增P2X3基因的引物对为:TGGCGTTCTGGGTATTAAGATCGG(正义);CAGTGGCCTGGTCACTGGCGA(反义),反应条件为：95℃,2min,95℃,25s：65℃,25s;72℃,25s。用于扩增P2Y1基因的引物对为：CCCTGTCGTTGAAATCACAC(正义);ACGTCAGATGAGTACCTGCG(反义),反应条件为：95℃,2min,95℃,25s;58℃,25s;72℃,25s。用于扩增TRPV1基因的引物对为:TCAATTCCCACACACCTCCC(正义);GACATGCCACCCAGCAGG(反义),反应条件为：95℃,2min,95℃,20s：63℃,25s;72℃,25s。为标化PCR反应中各样本目的基因cDNA含量,减少各样本间因个体差异对结果分析的影响,同时对各样本的管家基因β-actin进行了扩增,引物对为:ATGGTGGGTATGGGTCAGAAGG(正义);TGGCTGGGGTGTTGAAGGTC(反义),反应条件为：95℃,2min：95℃,25s：58℃,25s：72℃,25s。 5.大鼠DRGP2X3受体免疫组化技术 大鼠断头致死,迅速取出腰段DRG,置于含4％多聚甲醛的0.1M的PBS中(pH7.2),过夜,然后将组织块转入含25％蔗糖的PBS中,直到组织块沉入底部。然后将组织迅速冷冻,并在Leica冷冻切片机上切成薄片,贴于明胶铺过的载玻片上。用0.02 M PBS冲洗三次,每次5分钟。在含10％马血清、0.2％Triton的PBS中预孵育30分钟,然后用P2X3、TRPV1抗体孵育,这些抗体用含10％马血清、0.2％Triton X-100和0.4％叠氮化纳的PBS稀释成1:200或1:400,25℃放置过夜。用PBS冲洗后,将结合Cy3的驴抗兔IgG用含1％NHS的PBS稀释成1:200,常温下孵育切片2小时。最后冲洗切片,用NIKON荧光显微镜观察结果。 6.大鼠DRG分离培养细胞的全细胞膜片钳记录 将酶解得到的DRG分离细胞置入记录小室,并以1ml/min的速度用细胞外液灌流。常温下进行全细胞膜片钳记录,所用仪器为Axopatch 200B放大器。钳制电压为-60mV。记录膜电流应用低通滤波(10KHz,-3dB)。数据用pClamp9.0记录并处理。用EXCEL进行t检验。原始图用Ciampfit(pCLAMP software)记录并用Origin7绘图。 所有的药物稀释后通过ALA-VM8灌流系统给予,其中一管给予正常Krebs液,用来快速终止给药。激动剂每次给予4s,间隔2min。灌流用外液成分(mmol/L);NaCl 154,KCl 4.7,MgCl2 1.2,CaCl2 2.5,Hepes 10及glucose 5.6;用NaOH将pH值调成7.4.记录电极电阻2～5MΩ。所充电极内液成分为(mmol/L):KCl 120,HEPES 10,tripotassium citrate 10和EGTA 10;用KOH将pH值调成7.2。 结论： 1、在雌性大鼠,随着雌激素浓度增高,其外周机械性痛阈明显增高,而热痛阈明显降低。雄性大鼠去睾丸后外周机械性痛阈和热痛阈均无明显改变,而给予雌激素替代后,机械性痛阈增高,热痛阈降低。提示外周痛觉改变和体内雌激素水平的变化有关。 2、实时定量RT-PCR和免疫组化实验证实,雌二醇可以通过雌激素受体ER,明显抑制DRG中P2X3 mRNA,增加P2Y1 mRNA。提示雌激素可以通过基因组机制,调节初级感觉传入神经元中P2X3和P2Y1受体的表达,从而对痛觉信号的初级传入起到调节作用。 3、在分离培养的DRG细胞上,雌二醇可以通过膜上ER的类似位点,经过PKC和PKA途径,快速抑制P2X3受体介导的瞬时型电流和双相型电流的快速成分,但对缓慢型电流无影响。提示雌激素可以通过非基因组机制,特异性地抑制初级感觉传入神经元上P2X3受体的功能。 4、大鼠去卵巢后结肠致炎,腰骶段DRG中P2X3mRNA稍降低,而结肠中P2X3mRNA显著降低,在其分离培养的DRG细胞上,雌二醇也通过ER快速调节P2X受体介导的瞬时型、双相型和缓慢型电流。提示雌激素也可以通过基因组机制和非基因组机制,对于炎症条件下的内脏感觉信号转导起到调节作用。 因而,我们认为,雌激素可以通过基因组机制或非基因组机制,调节DRG小直径神经元上ATP受体的表达和功能,从而对正常及肠道炎症时外周痛觉(包括内脏痛觉)信号的转导起到重要的调节作用。