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低温是限制冷敏感植物产量和地理分布的重要因素。生物膜受低温伤害的初始位点。高等植物的耐冷性与类囊体膜的磷脂酰甘油(PG)顺式不饱和脂肪酸水平密切相关。由于叶绿体中磷脂酰甘油(PG)的sn-2位主要被饱和脂肪酸或反式不饱和脂肪酸所占据,因而PG在sn-1位的顺式不饱和脂肪酸水平决定了植物的抗冷性。决定PG中sn-1位顺式不饱和脂肪酸水平的是叶绿体甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT:.EC2.3.1.15)对脂肪酰基底物的选择性。GPAT是PG生物合成过程中的第一个酰基脂化酶,它将脂肪酰基转移到甘油-3-磷酸的sn-1位上合成1-酰基-Sn-甘油-3-磷酸(溶血磷脂酸)。来源于抗冷性不同的植物的叶绿体GPAT对底物酰基具有不同的选择性。一般来说,抗冷植物中GPAT优先选择C18:1-ACP作为底物,因此在这些植物中PG的sn-1位上就含有较高比例的18:1脂肪酸,这些脂肪酸可以在酰基脂肪酸去饱和酶的作用下进一步去饱和化成为顺式多不饱和脂肪酸；然而在冷敏感植物中,GPAT很难区分C18:1-ACP和C16:0-ACP,结果在sn-1位会有很高比例的16:0脂肪酸。由于16:0脂肪酸不能被进一步去饱和形成顺式不饱和脂肪酸,结果这些植物中PG的sn-1位顺式不饱和脂肪酸含量较低。
本研究从麻疯树叶片中分离到叶绿体甘油-3-磷酸酰基转移酶基因,并对该基因的表达和功能进行了分析。主要结果如下:
1.利用同源序列设计简并引物,通过RT-PCR的方法从麻疯树叶片克隆到甘油-3-磷酸酰基转移酶基因的中间片段,通过5’-RACE和3’-RACE分别克隆到5’和3’片段,拼接后设计特异引物扩增到全长cDNA,命名为JcGPAT(FJ952147)。JcGPAT的cDNA全长为1516 bp,其编码区为1389 bp,由此推断GPAT蛋白应包含462个氨基酸,分子量约为51.26 kDa,推定的蛋白质等电点为7.01。结构同源性分析表明JcGPAT有四个序列保守的结构域,blockⅠ的组氨酸和天冬氨酸残基,blockⅢ的甘氨酸残基和blockⅣ的脯氨酸残基都是绝对保守的,它们组成了一个重要的催化位点。
2.利用半定量RT-PCR分析了JcGPAT基因在麻疯树不同器官和种子的不同发育期的表达模式,结果表明:JcGPAT基因在麻疯树各器官中均有表达,在种子中的表达量最高,在茎中的表达量较低。在种子发育过程中,JcGPAT在种子发育初期的表达量较高,后期表达量减弱后又显著增强。
3.将麻疯树植株置于12℃处理4 h、12 h、24 h和48 h后利用半定量RT-PCR检测JcGPAT的表达情况。结果表明在12℃条件下,JcGPAT的表达量先增加,处理12 h后表达量逐渐降低,说明JcGPAT的表达受低温诱导。
4.构建JcGPAT组成型表达载体,采用农杆菌介导的花序浸染法将JcGPAT基因转化到拟南芥哥伦比亚生态型(Col)野生型植株中,获得超表达JcGPAT基因的转基因株系,为将来研究植物脂肪酸组份变化与低温胁迫的关系打下了基础。
本研究中JcGPAT基因的克隆和表达分析为研究麻疯树JcGPAT功能与其冷敏感性的关系,以及麻疯树耐冷性基因工程改良提供了实验基础和理论依据。