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目的:膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一,具有易复发的特点,病因复杂,既有内在的遗传因素,又有外在的环境因素。长期接触芳香族类物质、吸烟、膀胱慢性感染、膀胱结石以及尿路梗阻等是较为明确的致病危险因素。但其发生发展的机制尚不清晰。非编码RNA是一类广泛存在并且不能翻译成蛋白质的RNA。其中长度在200nt以上的LncRNA(long non-coding RNA,LncRNA)和18~24nt的微小RNA(microRNA,miRNA)已被证明在肿瘤细胞生物学功能的调控过程中发挥着重要的作用,并且非编码RNA相互作用对肿瘤发生发展的调控机制成为研究的热点,但非编码RNA对膀胱肿瘤的调控机制尚不明确。因此,本研究拟通过探索LncRNA/miRNA/关键蛋白信号通路在膀胱癌细胞中的作用机制,为膀胱癌的诊断提供新的分子标志物,为膀胱癌的治疗提供新的思路。研究方法:1.膀胱癌中拟研究关键蛋白的确定及其上游miRNA的筛选及检测通过Targetscan,DIANA等在线数据库,查找拟研究关键蛋白fascin1的上游miRNA。并通过GEPIA,oncoLnc,TCGA等在线数据库对感兴趣的关键蛋白fascin1及miRNA进行检索,查看数据库中患者的生存情况及在膀胱癌中的表达情况,并综合文献从中确定拟研究的miRNA。从实验室标本库中选取60例病理诊断明确的膀胱癌病例组织及23例膀胱癌旁组织,提取RNA,通过qPCR技术检测fascin1及miRNA的表达情况。通过相关性分析检测fascin1与miRNA之间的相关情况。培养多个细胞系的膀胱癌细胞,提取RNA,通过qPCR技术检测miRNA的表达情况。2.miRNA对下游靶基因调控功能的验证及其在膀胱癌细胞系中的功能通过双荧光素报告基因系统确定结合位点,验证miRNA与fascin1 mRNA的结合;设计构建miRNA的模拟物以及模拟物的阴性对照/抑制物及抑制物的阴性对照,分别转染膀胱癌细胞系,通过qPCR技术及western blot技术检测下游靶蛋白表达的变化情况;通过设计western blot回复实验进一步验证miRNA对fascin1蛋白表达的调控作用;通过transwell实验检测miRNA对膀胱癌细胞侵袭迁移能力的影响;通过设计transwell回复实验进一步验证miRNA对fascin1蛋白表达的调控后对膀胱癌细胞侵袭迁移能力的影响;通过流式细胞仪检测Propidium Iodide标记细胞的周期变化情况;通过荧光显微镜检测5-Ethynyl-2’-deoxyuridine(EdU)标记细胞的增殖变化情况;通过实时无标记细胞分析仪(RTCA)进一步检测细胞的增值变化情况。3.miRNA上游LncRNA的筛选及检测通过miRwalk,DIANA等在线数据库,查找miRNA的上游LncRNA。并通过GEPIA,oncoLnc,TCGA等在线数据库对LncRNA进行检索,查看数据库中患者的生存情况及在膀胱癌中的表达情况,并综合文献从中确定拟研究的LncRNA。从实验室标本库中选取10例病理诊断明确的膀胱癌病例组织及其对应的癌旁组织,提取RNA,通过qPCR技术检测LncRNA的表达情况。利用之前选取的60例病理诊断明确的膀胱癌病例组织及23例膀胱癌旁组织,提取RNA,通过qPCR技术进一步检测LncRNA的表达情况。通过相关性分析检测LncRNA与miRNA,LncRNA与fascin1之间的相关情况。培养多个细胞系的膀胱癌细胞,提取RNA,通过qPCR技术检测LncRNA的表达情况。通过原位杂交技术检测LncRNA在膀胱癌中的亚细胞定位,通过核质RNA分离技术进一步检测LncRNA在膀胱癌细胞核与细胞质的分布情况。4.LncRNA对下游miRNA及fascin1的调控功能的验证及其在膀胱癌细胞中的功能通过双荧光素报告基因系统确定结合位点,验证LncRNA与miRNA的结合;通过RIP实验进一步验证LncRNA与miRNA的结合;设计构建LncRNA的抑制物及其阴性对照/过表达质粒及其阴性对照,分别转染膀胱癌细胞系。通过qPCR技术检测下游miRNA及fascin1 RNA水平的变化情况,通过western blot检测fascin1蛋白水平的变化情况;通过设计western blot回复实验进一步验证LncRNA对下游fascin1的调控作用;通过transwell实验检测LncRNA对膀胱癌细胞侵袭迁移能力的影响;通过设计transwell回复实验进一步验证LncRNA对miRNA表达的调控后对膀胱癌细胞侵袭迁移能力的影响;通过流式细胞仪检测Annexin V-FITC及Propidium Iodide标记的细胞凋亡的变化情况;通过流式细胞仪检测Propidium Iodide标记细胞的周期变化情况;通过荧光显微镜检测5-Ethynyl-2’-deoxyuridine(EdU)标记细胞的增殖变化情况;通过实时无标记细胞分析仪进一步检测细胞的增值变化情况;通过构建LncRNA稳定过表达的细胞系进行裸鼠成瘤实验进一步验证其对细胞增殖的作用;通过对裸鼠成瘤的瘤体组织进行免疫组化实验进一步验证其对fascin1的调控作用。5.LncRNA/miRNA/fascin1信号轴参与TGF-β1相关信号通路调控细胞侵袭迁移功能的验证膀胱癌细胞系经过TGF-β1处理后,通过qPCR技术检测LncRNA、miRNA、以及fascin1的RNA水平的变化情况;通过western blot技术检测fascin1蛋白水平的变化情况;通过设计western blot回复实验验证LncRNA及miRNA在TGF-β1调控fascin1的过程中的作用;通过设计transwell回复实验进一步验证LncRNA及miRNA在TGF-β1调控细胞侵袭迁移过程中的作用。结果:1.通过数据库筛选并根据生存分析及表达相关性分析最终确定miR-200b为拟研究的fascin1上游miRNA。生存分析结果显示fascin1高表达组膀胱癌患者的生存时间低于fascin1低表达组膀胱癌患者的生存时间,miR-200b高表达组膀胱癌患者的生存时间高于miR-200b低表达组的生存时间。qPCR检测组织中fascin1在癌组织中较癌旁组织高表达,miR-200b在癌组织与癌旁组织中表达差异不明显。组织中fascin1与miR-200b的表达呈负相关。Fascin1在高级别膀胱癌细胞系中呈高表达,miR-200b在高级别膀胱癌中低表达。2.双荧光素酶报告基因系统显示miR-200b可与fascin1的3’UTR区域特异性结合,下调fascin1的表达。qPCR结果显示在膀胱癌细胞中上调miR-200b后,fascin1的表达下降,下调miR-200b后,fascin1的表达上升。Western blot结果显示上调miR-200b后,fascin1的表达下降,下调miR-200b后,fascin1的表达上升。Western blot回复实验结果显示miR-200b抑制物可拮抗fascin1抑制物对fascin1的敲减作用,上调fascin1的表达。Transwell实验结果显示上调miR-200b可导致膀胱癌细胞迁移和侵袭能力的减弱,下调miR-200b可导致膀胱癌细胞迁移和侵袭能力的增强。Transwell回复实验结果显示miR-200b可通过调控fascin1的表达进而影响膀胱癌细胞的迁移及侵袭能力。流式细胞仪周期实验结果显示上调miR-200b对膀胱癌细胞周期起到一定的阻滞作用,下调miR-200b对膀胱癌细胞周期起到一定的促进作用。EdU实验结果显示上调miR-200b抑制膀胱癌细胞的增殖,下调miR-200b促进膀胱癌细胞的增殖。实时无标记细胞分析仪结果显示上调miR-200b抑制膀胱癌细胞的增殖,下调miR-200b促进膀胱癌细胞的增殖。3.通过数据库筛选并根据生存分析及表达相关性分析最终确定ZEB1-AS1为拟研究的miR-200b的上游LncRNA。总体生存率结果显示ZEB1-AS1高表达组膀胱癌患者的生存时间与ZEB1-AS1低表达组膀胱癌患者的生存时间并无显著差异,但无病生存率结果显示ZEB1-AS1高表达组的膀胱癌患者无病生存时间低于ZEB1-AS1低表达组膀胱癌患者的无病生存时间。qPCR检测组织中ZEB1-AS1的表达情况发现,ZEB1-AS1在癌组织中较癌旁组织高表达,表达差异明显。组织中ZEB1-AS1与miR-200b的表达呈负相关,ZEB1-AS1与fascin1的表达呈正相关。荧光原位杂交结果显示ZEB1-AS1在细胞核及细胞质内均有存在。核质RNA提取结果显示ZEB1-AS1在细胞核及细胞质内的含量大致相同。4.双荧光素酶报告基因系统结果显示ZEB1-AS1可与miR-200b发生特异性结合,影响miR-200b的功能。RIP实验结果显示ZEB1-AS1可与miR-200b结合,影响miR-200b的功能。qPCR结果显示下调ZEB1-AS1后,下游miR-200b的表达上升,下游fascin1的表达量下降;上调ZEB1-AS1后,下游miR-200b的表达下降,下游fascin1的表达量上升。western blot结果显示下调ZEB1-AS1后,下游fascin1的表达量下降;上调ZEB1-AS1后,下游fascin1的表达量上升。Western blot回复实验结果显示过表达ZEB1-AS1可拮抗miR-200b对fascin1的抑制作用。Transwell实验结果显示下调ZEB1-AS1可导致膀胱癌细胞迁移和侵袭能力的减弱,上调ZEB1-AS1可导致膀胱癌细胞迁移和侵袭能力的增强。Transwell回复实验结果显示ZEB1-AS1可通过调控miR-200b的表达进而影响膀胱癌细胞的迁移及侵袭能力。流式细胞仪凋亡实验结果显示下调ZEB1-AS1可在一定程度上促进膀胱癌细胞的凋亡,上调ZEB1-AS1可在一定程度上抑制膀胱癌细胞的凋亡。流式细胞仪周期实验结果显示下调ZEB1-AS1对膀胱癌细胞周期起到一定的阻滞作用,上调ZEB1-AS1对膀胱癌细胞周期起到一定的促进作用。EdU实验结果显示下调ZEB1-AS1抑制膀胱癌细胞的增殖,上调ZEB1-AS1促进膀胱癌细胞的增殖。实时无标记细胞分析仪结果显示下调ZEB1-AS1抑制膀胱癌细胞的增殖,上调ZEB1-AS1促进膀胱癌细胞的增殖。裸鼠成瘤实验结果显示ZEB1-AS1过表达组的小鼠肿瘤较阴性对照组小鼠肿瘤生长更快,体积更大。裸鼠成瘤瘤体组织免疫组化实验结果显示ZEB1-AS1过表达组的小鼠肿瘤较阴性对照组小鼠肿瘤fascin及ki67表达量更高。5.TGF-β1处理后,qPCR结果显示ZEB1-AS1表达上升、miR-200b表达下降、fascin1表达上升,western blot结果显示fascin1表达上升。Western blot回复实验结果显示敲减ZEB1-AS1可拮抗TGF-β1对fascin1表达的促进作用,过表达miR-200b可拮抗TGF-β1对fascin1表达的促进作用。Transwell回复实验结果显示敲减ZEB1-AS1可拮抗TGF-β1对膀胱癌细胞迁移侵袭的促进作用,过表达miR-200b可拮抗TGF-β1对膀胱癌细胞迁移侵袭的促进作用。结论:1.miR-200b可在膀胱癌中下调fascin1的表达从而抑制细胞的迁移和侵袭,并且miR-200b可在一定程度上阻滞细胞周期,抑制细胞增殖。2.ZEB1-AS1可在膀胱癌中竞争结合miR-200b从而间接上调fascin1的表达从而促进细胞的迁移和侵袭,并且ZEB1-AS1可在一定程度上抑制细胞凋亡,促进细胞周期,促进细胞增殖。3.ZEB1-AS1/miR-200b/fascin信号轴在影响细胞迁移侵袭的过程中受到TGF-β1相关信号通路的调控。