蛋白酶抑制剂的主要功能是抑制蛋白酶活性，广泛分布于动物、植物、真菌、细菌和病毒等生物体内。在蛋白酶抑制剂中分布最多，研究最为广泛的就是丝氨酸蛋白酶抑制剂（serine protease inhibitors，SPIs），该类蛋白酶抑制剂主要调节蛋白酶的水解级联过程，调控动物、昆虫体内凝血、炎症反应、弹性蛋白修复、组织分化和凋亡等过程;在植物中，丝氨酸蛋白酶抑制剂还可以防御昆虫和病原菌的侵害，调控逆境中蛋白酶的过度水解破坏，以及在增加抗虫性等都起到了重要作用。丝氨酸蛋白酶按照作用机理可以分为三类:典型、非典型和serpin。典型丝氨酸蛋白酶采取传统的锁钥模型结合底物，而serpin类抑制剂则是通过活性中心环状区（reactive centre loop）与底物以牢固的共价结合方式形成复合体，产生不可逆的抑制效果。　　本文的研究中将模式生物家蚕作为主要研究对象。研究表明，丝氨酸蛋白酶抑制剂通过精确的调控蛋白酶水解，参与家蚕的生长、发育、蜕皮和变态等生长发育过程，并且与抵御病原微生物入侵响应过程密切相关。但是已有研究的serpin类蛋白酶抑制剂集中在脂肪体、丝腺、消化系统、体液和茧壳中，对于体壁中的研究较少，不仅如此，现有的研究报道集中在蛋白酶抑制剂的分离和鉴定阶段，对于很多重要的serpin类蛋白酶抑制剂的结构与功能之间的关系尚不明了。在家蚕的免疫防御过程中，病原微生物主要通过分泌胰蛋白酶等酶类水解穿透体壁。所以本文对家蚕体壁中的胰蛋白酶抑制剂做了详细的研究，并且对SW-AT-1的结构与功能间的关系做了详细阐述。　　本文建立了以硫酸铵沉淀和Trypsin inhibitor Sepharose4B亲和层析为主要步骤的纯化方法，从P50品系的体壁总蛋白中部分纯化了胰蛋白酶抑制剂(trypsin inhibitors，TIs)。通过明胶活性电泳技术，在分离胶上观察到具有胰蛋白酶抑制性的条带在12条以上，与体液中的活性分离结果相比，体壁中的胰蛋白酶抑制剂分布较少，其主要不同活性位置在胶上分离出4个条带，分别在70 kDa、35-45 kDa和25 kDa附近;在热稳定性研究中，家蚕体壁中的胰蛋白酶抑制剂活性条带在60℃以上开始减少和变淡，说明其热稳定性不高;仅有两个分子量在18-25 kDa间的活性条带表现出了极强的热稳定性，甚至在100℃处理后，仍然可以保持一定活性。酸碱稳定性实验中观察到体壁中的所有胰蛋白酶抑制剂活性条带变化差异微小，说明这些TIs可以在酸性(pH3)或弱碱(pH10)环境中保持稳定的活性，具有一定的酸碱稳定性。　　将部分纯化后的SDS-PAGE和活性电泳结果对照，选择纯化后分离蛋白浓度较高，在活性胶检测中表现出强抑制活性的3条胶条，并且这三个胶条对应蛋白酶抑制剂都是体壁中特有的。切下酶解后进行MALDI-TOF-MASS质谱鉴定，收集到大量的肽段质量指纹谱数据(PMF)，通过在Mascot的UniProt数据库中检索找到对应PMF信息的蛋白。鉴定出三个抑制剂相关蛋白，分别是silkworm antitrypsin isoform1(SW-AT-1)、类丝氨酸蛋白酶抑制剂和一个肽酶，UniProt登陆号分别为:C7ASM9、Q1HPQ5和D2KMR2，理论分子量分别为43428.4 Da、43345.43 Da和77611.43 Da，等电点分别为5.41、5.19和6.37。通过生物信息学分析，发现silkworm antitrypsinisoform1属于serpin家族;Q1HPQ5则是一种具有特定水解活性位点，在部分水解后才能激活的胰蛋白酶抑制剂前体。下一步的研究旨在对鉴定的蛋白酶抑制剂的结构与功能关系探究，所以我们选择将SW-AT-1和Q1HPQ5进行基因克隆，并通过构建原核重组载体，进行体外重组表达。对表达后的重组蛋白进行结构与功能研究。　　将已获得的蛋白质氨基酸序列通过NCBI的Protein BLAST，找到和SW-AT-1和Q1HPQ5相对应的编码mRNA全序列，GenBank登陆号分别为:FJ613793和NM_001046997.2。已有报道表明SWAT基因有10个外显子和9个内含子，其中9个外显子分别构成4个选择性拼接选择性拼接异构体，分别为SW-AT-1、SW-AT-2、SW-AT-3和SW-AT-4，已有文献报道SW-AT-1在体内表达量最高，并主要存在于体壁中，这四个选择性拼接异构体基因的碱基差异对位于mRNA序列的1200-1210 bp的位置，也是成熟肽编码区域的末端。通过氨基酸序列对比，确定从体壁中分离纯化得到的鉴定蛋白就是SW-AT-1，所以选择SW-AT-1的CDS区域作为基因克隆的模版。在目的片段的PCR扩增和测序结果中只检测到SW-AT-1基因，而未检测到其他的三个选择性拼接异构体基因。该基因CDS区含有1310个核苷酸，共编码392个氨基酸，实验中设计的特异引物切除了信号肽编码区。蛋白质结构分析也表明SW-AT-1含有典型的serpin家族抑制剂的结构域。实验中通过菌液PCR、双酶切验证和DNA序列测序验证原核重组pET-28a-SW-AT-1的构建成功。将重组载体转入大肠杆菌C43表达菌株进行原核表达，结果显示SW-AT-1存在破碎菌体的上清液中，而Q1HPQ5则形成无活性的包涵体沉淀，无法进行下一步实验。　　将大肠杆菌C43中表达的重组蛋白利用Ni-NTA亲和层析法纯化，并洗脱出大量的纯化蛋白。在测定纯化的SW-AT-1重组蛋白抑制活性中，首次发现SW-AT-1还具有胰蛋白酶抑制功能。其胰蛋白酶活性热变性温度在47-50℃之间，热稳定性不高，与之前的明胶活性电泳结果相符;其酸碱稳定性则相对较高，在pH3-pH10之间活性很稳定，在强酸或碱性环境中无活性。对胰凝乳蛋白酶的抑制活性测定后，SW-AT-1均表现出同样的稳定性。接着通过抑制剂常数的确定，分析表明SW-AT-1对两种蛋白酶的亲和力极高，Ki值分别为为1.73×10-10 M和0.86×10-10 M，与胰凝乳蛋白酶的结合力力更强，在酶的动力学作用关系上表现为竞争性抑制。　　通过3D建模对SW-AT-1的三级结构进行模拟，结构模拟采取基于SWISS-MODEL服务器的同源预测方法，蛋白模板为烟草天蛾serpin1K复合体(PDB序号:1SEK)，Procheck和Verify3D的模型评估结果均证明模拟结构正确、可靠。接着在NCBI的保守结构与分析中，再次确定RCL区域的结构模拟可靠性，三维模拟结构表明确定的氨基酸位点G327，A328，E329和A330位于RCL的N-端，F352，N353，A354，N355，K356和P357位于RCL的C-段，对应上述10个位点进行定点氨基酸残基替换的突变实验，构建出10个突变体G327A、A328G、E329G、A330G、F352A、N353D、A354G、N355S、K356G和P357G。采取同样的步骤进行原核表达和纯化，获得的纯化蛋白和野生型进行圆二性色谱分析，结果显示野生型二级结构中:α螺旋占33％，β折叠占16％;野生型SW-AT在不同温度和pH中的活性变化与三级结构的圆二色性图谱变化呈现一致性，而二级结构的变化则无对应性，所以SW-AT-1的三级结构决定了其抑制功能。在3D模拟结构中，RCL是SW-AT-1结构域中的一个凸出暴露区域，该区域是控制SW-AT-1功能的关键区域;并且在突变体的活性检测和圆二色性图谱中，突变体G327A和E329G均表现出抑制活性的剧烈降低以及二级、三级结构的明显变化，证明G327和E329氨基酸残基是RCL正确折叠与否的关键位点;除此之外，突变体K356G则表现出活性的明显升高和三级结构变化，以及三级结构的热稳定性提高，证明在RCL区域的近C-端区域，将末端位点替换为较小的氨基酸残基，可以增加RCL与蛋白酶底物的结合能力，并增加结构稳定性。　　综上所述，本文通过实验首次确定了SW-AT-1对胰凝乳蛋白酶具有抑制功能，并且确定了G327和E329残基为活性中心环状区近N-端的关键位点，决定了活性中心环状区在结合蛋白酶底物时能否正确折叠;同时活性中心环状区的近C-端也可以影响SW-AT-1的功能。