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实验一卵巢玻璃化冷冻原位移植技术对子代小鼠生长发育和糖代谢的影响目的探索卵巢玻璃化冷冻原位移植技术对子代鼠生长发育及糖代谢的影响。方法建立卵巢玻璃化冷冻原位移植小鼠模型和新鲜卵巢原位移植小鼠模型,以其交配后出生的子代为研究对象,将实验分为新鲜卵巢原位移植子代组,冷冻卵巢原位移植子代组,另设同期自然交配出生子代组为正常对照组(以下简称新鲜组、冷冻组、正常组)。测量自出生第1天起至第6月3组小鼠体重变化;测量3组小鼠6月龄时空腹血糖值和糖耐量;用ELISA技术检测3组小鼠6月龄时空腹胰岛素水平。结果雌性小鼠在出生后第1周、第2周、第3周时,冷冻组体重较正常组和新鲜组体重均降低(P<0.05),但在第3月时,冷冻组仅较新鲜组体重降低(P<0.05),雄性小鼠在出生后第1天、第3天、第1周、第2周、第3周时,冷冻组较正常组体重降低(P<0.05),在第1周、第3周时,冷冻组较新鲜组体重降低(P<0.05),并且在出生后第1周时,新鲜组也较正常组体重降低(P<0.05);小鼠空腹血糖和糖耐量检测结果表明:雌性小鼠生长至第6个月时,新鲜组和冷冻组小鼠空腹血糖均较正常组升高(P<0.05),雄性小鼠仅新鲜组较正常组空腹血糖升高(P<0.05),雌雄小鼠新鲜组和冷冻组之间均无显著性差异(P>0.05)。腹腔注射葡萄糖测定三组小鼠糖耐量,在注射后120 min时,雌性小鼠新鲜组血糖水平较正常组升高(P<0.05),雄性小鼠新鲜组和冷冻组血糖水平均较正常组升高(P<0.05),雌雄小鼠冷冻组与新鲜组之间均无显著性差异(P>0.05);ELISA实验结果表明:新鲜组和冷冻组空腹胰岛素水平均较正常组升高(P<0.05),冷冻组和新鲜组之间无显著性差异(P>0.05)。结论原位移植新鲜和玻璃化冻融卵巢后出生的子代均出现了出生低体重、青春期前生长迟缓并伴随成年后空腹血糖升高、胰岛素抵抗和糖耐量损害等糖代谢紊乱的症状。实验二卵巢玻璃化冷冻原位移植技术影响子代小鼠生长发育和糖代谢的机制研究目的研究卵巢玻璃化冷冻原位移植技术中产生的包括化学损伤、渗透损伤和氧化应激损伤是否会改变卵巢内配子的表观遗传信息从而影响子代与生长发育、糖代谢相关基因Grb10的表达。阐明表观遗传修饰调控Grb10表达引起原位移植玻璃化冻融卵巢出生子代鼠生长迟缓和糖代谢紊乱的分子机制。方法利用卵巢玻璃化冷冻原位移植出生子代6月龄小鼠,获取小鼠肝脏组织。通过Western blot技术检测肝脏组织中Dnmt1、Grb10及Grb10所调节的下游信号通路磷酸化因子P-IGF1R、P-IRS2、P-AKT、P-MAPK蛋白的表达;通过qRT-PCR技术检测肝脏组织中Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b、Uhrf1、Grb10 mRNA与miR-145b的表达;构建野生型(psiCHECK-2-mGRB10-3U-W)和突变型(psiCHECK-2-mGRB10-3U-M)双荧光素酶报告基因载体,野生型和突变型双荧光素酶载体分别+(mmiR-145b mimics、mmiR-145b mimics NTC)转染到293T细胞中,检测荧光素酶活性,验证miR-145b与Grb10之间的调控关系;用Sequenom MassARRAY技术检测Grb10启动子区甲基化率。结果Grb10蛋白和mRNA表达新鲜组和冷冻组均较正常组升高(P<0.05);P-IGF1R、P-IRS2、P-AKT、P-MAPK蛋白表达冷冻组和新鲜组均较正常组降低(P<0.05),且冷冻组与新鲜组之间无显著性差异(P>0.05);Dnmt1蛋白表达冷冻组较正常组升高(P<0.05),Dnmt1 mRNA和Dnmt3a mRNA表达冷冻组和新鲜组均较正常组升高(P<0.05),且新鲜组表达高于冷冻组(P<0.05);Dnmt3b mRNA和Uhrf1 mRNA表达冷冻组和新鲜组均较正常组升高(P<0.05),且冷冻组与新鲜组之间无显著性差异(P>0.05);miR-145b mRNA表达冷冻组和新鲜组均较正常组降低(P<0.05),但冷冻组表达高于新鲜组(P<0.05);双荧光素酶报告基因报告结果显示miR-145b可抑制野生型载体荧光的表达(P<0.05),而对突变型载体荧光的表达无抑制作用;Sequenom结果显示冷冻组小鼠肝脏Grb10基因启动子区所检测的11个CpG位点甲基化率有4个CpG位点的甲基化率较正常组显著下降(P<0.05),且冷冻组与新鲜组之间无显著性差异(P>0.05)。结论卵巢玻璃化冷冻原位移植技术能够从转录前水平通过引起子代肝脏Grb10基因启动子区CpG位点的甲基化率降低,和从转录后水平通过引起子代肝脏Uhrf1/Dnmts表达升高介导DNA甲基化导致miR-145b表达降低两方面调控Grb10过表达,通过抑制胰岛素信号通路下游磷酸化因子表达降低,导致出生子代出现生长迟缓和糖代谢紊乱的风险升高;可能是移植缺血再灌注损伤而非冷冻环节引起子代出现生长迟缓和糖代谢紊乱的风险升高。