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神经酸(C24:1)是一种可以恢复神经纤维活性并且促进神经细胞再生的超长链单不饱和脂肪酸,能够促进大脑发育以及维持正常的脑功能,对于许多神经系统疾病都具有显著的疗效。目前神经酸主要从极少数动、植物中提取,成本高、价格昂贵,神经酸无法工业化生产的主要障碍是缺少高产神经酸的工程菌。本课题在构建神经酸合成通路的基础上,拟通过更换表达宿主、酿酒酵母产神经酸的代谢调控和发酵条件优化等方法提高神经酸的产量。1、利用粘红酵母作为表达宿主生产神经酸。将带有关键限速酶基因的质粒pYES-P TEF1-KCS-TCYC-PPGK-FAE1-TCYC转入粘红酵母中过表达。发酵结果表明,KCS-FAE1的表达对粘红酵母的脂肪酸组成没有产生太大影响,也没有产生神经酸。虽然粘红酵母的油酸含量很丰富,但是目前对其脂肪酸延伸体系和调控机制的研究很少,因此粘红酵母暂时无法作为生产神经酸的宿主菌。2、酿酒酵母产神经酸的代谢调控。在构建pYES-PTEF1-KCS-TCYC-PPGK-FAE1-TCYC质粒的基础上,首先过表达转录因子Mga2,促进胞内底物油酸的合成;其次尝试更换带有G418抗性的筛选标记,使工程菌能够在营养更丰富的YPD培养基上生长;然后敲除酵母自身的脂肪酸延伸酶ELO2以降低代谢旁路的竞争作用;最后将外源的KCS整合到酿酒酵母的基因组上,增加KCS基因的稳定性和拷贝数。结果表明,更换G418筛选标记后,工程菌的生物量明显提高,但是神经酸产量略有下降;过表达Mga2可以提高C16:1和C20:1的产量,但是会降低C24:1的产量;敲除Elo2的工程菌神经酸产量提高了 60.3%;整合KCS到基因组后,神经酸产量略有下降。3、工程菌产神经酸培养条件的优化。随着C/N的增加,神经酸的产量呈下降的趋势,在C/N摩尔比为4.4时,C24:1的产量最高为0.959%。低温发酵有利于单不饱和脂肪酸产量的提高,18℃对比22℃发酵时神经酸产量提高了 24.32%。调高发酵液初始的pH值有利于酿酒酵母生物量的提高,初始pH为6.0时最利于神经酸的积累。发酵到第12天神经酸的产量最高达到0.55%,其次是第6天神经酸产量为0.48%,转速对神经酸产量影响较小。外源添加0.5%吐温80和1g/L Asn时,神经酸产量分别提高了 81.9%和48%。利用响应面优化法探究了吐温80、Asn和发酵时间对工程菌产神经酸的交互影响,软件预测最佳培养条件为:油酸1.47 mM、Asn 1.97 g/L、发酵8.57天,工程菌神经酸产量最高可达到1.37%。