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前言卵巢癌在妇科恶性肿瘤中病死率居首位,卵巢癌的发生发展机制一直是妇科肿瘤基础与临床研究探索的重点,了解卵巢癌生物学行为的控制方法及发生发展的分子机制对于卵巢癌的预防及治疗十分重要。卵巢癌的发生与发展是一个极其复杂的多因素的过程,目前对其发生机理尚不清楚。近年来,糖复合物和肿瘤的关系受到广泛关注。糖复合物是细胞膜的重要组成部分,对细胞-细胞、细胞-分子的识别十分重要,参与信号转导、分子粘附等分子相互作用,与细胞生长、凋亡、运动、分化等生命过程密切相关。细胞癌变后细胞膜上的糖复合物,特别是其糖链部分发生结构和量的变化。卵巢癌主要表现为II型糖链的改变,如Lewis y抗原。研究表明75%的上皮性卵巢癌出现Lewis y不同程度的过量表达,且增高的患者预后不良。我们在前期工作中利用基因转染技术将人α1,2-岩藻糖转移酶(α1,2-fucosyltransferase,α1,2-FT)基因转入卵巢癌细胞系RMG-I,建立了Lewis y稳定高表达卵巢癌细胞系RMG-I-H,发现转染后RMG-I-H细胞对化疗药5-FU的敏感性下降,提示Lewis y抗原具有提高卵巢癌细胞生存能力的作用。细胞表面的受体几乎都是糖蛋白,研究表明,改变糖基转移酶的表达可影响细胞表面受体的糖链结构,继而影响其表达数目及功能。我们在前期工作中利用基因芯片技术检测了α1,2-FT基因转染前后细胞系癌相关基因的表达差异,结果显示转染后细胞中有88种差异性表达基因,差异基因主要表现在细胞增殖、信号转导、蛋白氨基酸磷酸化、转录、凋亡等方面。因此,我们推测Lewis y可能作为信号转导通路上的重要结构参与细胞内信号转导,进而影响卵巢癌细胞的生物学行为。本研究主要在前期工作的基础上,利用已经建立的α1,2-FT及Lewis y稳定高表达细胞模型,探讨Lewis y抗原对卵巢癌细胞增殖的影响及作用机制,为研究卵巢癌的发生发展机制奠定基础,为卵巢癌的早期诊断及靶器官治疗提供理论依据。方法第一部分：RT-PCR方法检测基因转染前后细胞中α1,2-FT mRNA的表达；免疫细胞化学染色法检测细胞中Lewis y抗原的表达；MTT法检测基因转染前后细胞的增殖情况；流式细胞仪分析细胞周期；分别用α-L-岩藻糖苷酶和抗Lewis y抗体处理卵巢癌细胞系,MTT法检测处理后细胞的增殖情况。第二部分：RT-PCR方法检测基因转染前后细胞中EGFR, HER2/neu mRNAs的表达；Western blot方法检测基因转染前后细胞中EGFR, HER2/neu蛋白的表达；用EGFR及HER2/neu特异性抗体进行免疫沉淀,并应用抗Lewis y单克隆抗体为一抗进行Western印迹杂交,检测EGFR, HER2/neu上Lewis y抗原的表达情况；Western blot方法检测细胞中EGFR, HER2/neu蛋白的磷酸化情况。第三部分：Western blot方法检测基因转染前后细胞中PI3K／Akt和Raf/MEK/MAPK信号转导通路上重要信号分子的表达及磷酸化情况；分别用EGFR酪氨酸激酶特异性抑制剂ZD1839和抗Lewis y单克隆抗体处理细胞,Western blot方法检测上述重要信号分子的表达及磷酸化情况；MTT法检测细胞在不同浓度PI3K特异性抑制剂LY294002作用下的存活情况。结果第一部分：RT-PCR结果显示转染后细胞中al,2-FT mRNA表达显著增高。免疫细胞化学染色结果显示Lewis y抗原在转染后细胞中显著高表达。MTT结果显示随着细胞表面Lewis y的增多,卵巢癌细胞增殖加快。α-L-岩藻糖苷酶和抗Lewisy抗体都显著抑制细胞的增殖。细胞周期检测结果显示Lewis y高表达增强DNA合成,促进G0-G1期细胞进入S期和G2-M期,使细胞周期缩短。第二部分：RT-PCR结果显示转染后细胞中HER2/neu mRNA表达显著增高,而EGFR mRNA未见明显改变。免疫共沉淀结合Western blot检测到EGFR蛋白的表达在转染前后细胞中无明显变化,但基因转染后EGFR上Lewis y的相对含量较转染前显著增加；与EGFR相反,基因转染后HER2/neu蛋白的表达较转染前显著增加,但转染前后HER2/neu上Lewis y的相对含量却没有明显的变化。此外,Western blot还检测到基因转染后EGFR和HER2/neu的酪氨酸磷酸化水平都显著升高。第三部分：Western blot结果显示转染后细胞中Akt、ERK1／2总蛋白的表达未发生明显改变,但它们的磷酸化水平都显著增高；分别用EGFR酪氨酸激酶抑制剂ZD1839和抗Lewis y抗体处理后,转染前后细胞中磷酸化Akt、ERK1／2的表达水平都下降,尤其以转染后细胞下降得更明显,且存在于两种细胞中的高低区别也消失。MTT检测结果显示PI3K特异性抑制剂LY294002显著抑制Lewis y高表达卵巢癌细胞的增殖。结论1. Lewis y抗原促进卵巢癌细胞增殖,加快细胞周期进展。2. Lewis y抗原不但是EGFR还是HER2/neu结构上的一部分。3. Lewis y抗原作为EGFR家族结构上的一部分,其表达增加不但激活了EGFR及HER2/neu受体酪氨酸激酶,还进一步激活了EGFR家族下游的PI3K/Akt和Raf/MEK/MAPK信号转导通路,导致细胞核内HER2/neu等基因转录的加速,刺激DNA合成,最终促进细胞跳过G1期限制点进入S期,促进细胞增殖。4. PI3K/Akt信号转导通路在Lewis y抗原促进细胞增殖中起着重要的作用。