目的验证RTP801启动子的核心缺氧反应性增强子对CMV启动子下游VEGF₁₆₅和FGF₂的表达的增强作用，并进一步验证MLC-2v心肌特异性启动子的核心片段和RTP801启动子的核心缺氧反应性增强子调控下下游VEGF₁₆₅和FGF₂的心肌特异性和缺氧反应性高效表达。方法通过PCR方法从pSEC／Igκ-VEGF₁₆₅／IRES／IgK-FGF₂重组质粒中获取Igκ-VEGF₁₆₅／IRES／Igκ-FGF₂片段（Igκ为分泌引导信号Igκ-chain leader的DNA片段），接入pIERS载体中的多克隆位点中，构建了pIERS／Igκ-VEGF₁₆₅／IRES／Igκ-FGF₂重组质粒。利用PCR的方法，从小鼠基因组DNA中获取RTP801启动子（Genebank NC000076）的核心部分增强子（core hypoxia-response enhancer，core HRE）的337～511bp（加上两端酶切位点和保护碱基共202bp），替换pIERS／Igκ-VEGF₁₆₅／IRES／Igκ-FGF₂重组质粒上的CMV增强子（150～390bp），从而构建了pIRES／RTP801 core HRE／Igκ-VEGF₁₆₅／IRES／Igκ-FGF₂重组质粒。利用生物性可降解的聚乙烯亚胺（PEI）多分支树状聚合物将重组质粒体外转染293细胞，在正常和缺氧条件下分别培养36小时，Western-blot检测细胞内VEGF₁₆₅和FGF₂的表达。ELISA检测细胞培养液中分泌性蛋白VEGF₁₆₅和FGF₂的表达。利用PCR的方法，从大鼠基因组中获取心肌特异性的MLC-2v启动子，即心肌球蛋白轻链启动子（myosin lignt chain 2v promoter，Genebank U26708）的1714bp～1975bp的261bp的核心部分启动子（core promoter）（加上两端酶切位点和保护碱基共289bp），替换已构建的重组质粒pIRES／RTP801 HRE／Igκ-VEGF₁₆₅／IRES／Igκ-FGF₂上的CMV启动子，构建pIRES／MLC-2v core promoter／RTP801 core HRE／Igκ-VEGF₁₆₅／IRES／Igκ-FGF₂重组质粒，利用生物性可降解的聚乙烯亚胺（PEI）多分支树状聚合物将重组质粒体外转染大鼠心肌细胞系H₉C₂细胞和293细胞，在正常在正常和缺氧条件下分别培养36小时，Western-blot检测细胞内VEGF₁₆₅和FGF₂的表达并用ELISA检测细胞培养液中分泌性蛋白VEGF₁₆₅和FGF₂的表达。利用生物性可降解的聚乙烯亚胺（PEI）多分支树状聚合物将重组质粒体外转染大鼠心肌细胞系H₉C₂细胞和293细胞，在正常在正常和缺氧条件下分别培养12小时，以RT-PCR检测细胞内VEGF₁₆₅和FGF₂在mRNA水平的表达。结果真核表达载体pIRES／RTP801 HRE／Igκ-VEGF₁₆₅／IRES／Igκ-FGF₂经PCR和酶切分析及测序证实构建成功，Western-blot和ELISA检测证实重组质粒中的VEGF₁₆₅和FGF₂在RTP801HRE介导下在缺氧293细胞有高效的共表达。真核表达载体pIRES／MLC-2v core promoter／RTP801 core HRE／Igκ-VEGF₁₆₅／IRES／Igκ-FGF₂经PCR和酶切分析及测序证实构建成功，RT-PCR和ELISA检测证实，重组质粒中的VEGF₁₆₅和FGF₂在MLC-2v core promoter和RTP801HRE的介导下在缺氧的大鼠心肌细胞系H₉C₂细胞中有高效和特异的共表达。结论获取的RTP801的核心缺氧反应性增强子在缺氧状态下有显著增强下游基因表达的功能，由此构建的真核质粒pIRES／RTP801 HRE／Igκ-VEGF₁₆₅／IRES／Igκ-FGF₂在缺氧下高效表达VEGF₁₆₅和FGF₂。心肌特异性的MLC-2v启动子和RTP801的核心缺氧反应性增强子在共用时有增强下游基因心肌特异性和缺氧反应性高效表达的作用，由此构建的真核质粒pIRES／MLC-2v core promoter／RTP801 core HRE／Igκ-VEGF₁₆₅／IRES／Igκ-FGF₂在缺氧的大鼠心肌细胞系H₉C₂细胞中高效表达VEGF₁₆₅和FGF₂。本实验为进一步研究高效的针对缺血性疾病尤其是缺血性心脏病的基因治疗载体打下了一定的基础。