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目的: 本研究主要探讨HAS-2沉默前后对大肠癌细胞上皮间质转化(EMT)的影响以及HAS-2沉默前后对TGF-β调控EMT的影响。 方法: 带FAM荧光标记的阴性对照siRNA转染细胞后,用流式细胞仪检测siRNA转染效率,筛选最佳转染条件。之后用Real time PCR和Western blot分别从mRNA和蛋白水平检测HAS-2 siRNA干扰效率。用Western blot检测转染前后E-Cadherin、Vimentin、Slug蛋白表达水平变化,用Real time PCR检测转染前后E-Cadherin、Vimentin、snail mRNA表达水平变化。用10ng/mlTGF-β1分别刺激转染前后细胞,用Western blot检测刺激前后E-Cadherin、Vimentin蛋白水平变化,用Real time PCR检测刺激前后E-Cadherin、Vimentin、snail mRNA表达水平变化。用免疫荧光法观察TGF-β1刺激及HAS-2沉默对E-Cadherin、Vimentin表达变化的影响。 结果: 1、转染HAS-2 siRNA24小时后HAS-2 mRNA表达抑制率为(54.6±5.84)%;HAS-2蛋白在转染48小时后表达抑制率为(40.5±5.32)%。 2、HAS-2 siRNA转染48小时后E-Cadherin蛋白表达较阴性对照组上调,差别具有统计学意义(P<0.05);Vimentin蛋白及Slug蛋白表达较阴性对照组下调,差别具有统计学意义(P<0.05)。 3、用10ng/mlTGF-β1刺激后,未转染HAS-2siRNA组细胞48小时后E-Cadherin蛋白水平下调,差别具有统计学意义(P<0.05);Vimentin蛋白表达明显上调,差别具有统计学意义(P<0.05);已转染48小时组细胞E-Cadherin蛋白表达水平明显高于未转染组,差异具有统计学意义(P<0.05);未转染组细胞Vimentin蛋白表达水平较刺激前明显上调,差别具有统计学意义(P<0.05),转染组细胞Vimentin蛋白表达水平较未转染组明显下调,差别具有统计学意义(P<0.05)。 4、E-Cadherin mRNA在HAS-2siRNA转染组的表达量上调,差别具有统计学意义(P<0.05);Vimentin mRNA及Snail mRNA在转染组的表达量下调,差别具有统计学意义(P<0.05)。 5、TGF-β1刺激未转染HAS-2siRNA组细胞,E-Cadherin mRNA水平较刺激前下调,差别具有统计学意义(P<0.05);Vimentin及Snail mRNA表达较刺激前明显上调,差别均具有统计学意义(P<0.05)。TGF-β1刺激已转染24小时的细胞,E-Cadherin mRNA表达水平较刺激前明显下调,较刺激未转染组细胞表达水平上调,差别均具有统计学意义(P<0.05);Vimentin及Snail mRNA表达水平均较刺激前明显上调,较刺激未转染组表达水平下调,差别均具有统计学意义(P<0.05)。 6、经荧光显微镜观察,TGF-β1刺激前转染HAS-2siRNA组细胞E-cadherin表达较未转染组细胞增多,Vimentin表达较未转染组细胞减少;TGF-β1刺激后,未转染组细胞E-cadherin表达较刺激前减少,Vimentin表达较刺激前明显增多;转染组细胞E-cadherin表达较未转染组增多,Vimentin表达较未转染组明显减少。 结论: 1、HAS-2沉默对大肠癌细胞EMT有抑制作用,HAS-2可能对大肠癌细胞EMT有促进作用。 2、HAS-2沉默能够抑制TGF-β1对大肠癌细胞EMT的促进作用,TGF-β1可能通过HAS-2发挥促进大肠癌细胞EMT的作用。