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[目的]研究转运载体聚乙烯亚胺-藻酸盐(PEI-alginate)纳米粒转染的VEGFR-3siRNA靶向抑制人脐带血内皮祖细胞淋巴管新生的作用,探讨以淋巴管内皮祖细胞为靶点抑制肿瘤淋巴新生和淋巴转移的可行性。[方法]用Percoll非连续密度梯度离心法从胎儿脐带血中分离出单个核细胞,用流式细胞仪分析VEGFR-3+CD34+细胞和VEGFR-3+CD133+细胞在单个核细胞中所占的百分比。通过流式细胞仪分选出VEGFR-3+细胞,然后通过免疫细胞化学染色的方法鉴定VEGFR-3+细胞表面CD34和CD133的分布及表达。用VEGF-C诱导细胞数目的扩增。用水化法制备PEI-alginate纳米粒以及包封VEGFR-3siRNA制成PEI-alginate/siRNA纳米复合物,通过扫描电子显微镜及粒度分析仪检测纳米复合物的表面特征、粒径及表面电荷。按照人VEGFR-3的基因序列合成3段不同的siRNA,根据氮磷比(N/P)的不同,制备不同的纳米复合物。通过凝胶电泳阻滞法检测PEI-alginate纳米粒包封VEGFR-3siRNA的效率。用PEI-alginate纳米粒转染带有荧光标记的VEGFR-3siRNA,检测、VEGFR-3siRNA的转染细胞的效率。MTT法检测不同N/P比值的纳米复合物对细胞的毒性。透射电子显微镜检测用纳米复合物处理细胞后,纳米复合物在细胞内的分布及降解。通过MTT法、增殖细胞核抗原染色方法、跨膜迁移实验及Matrigel凝胶内毛细淋巴管样结构形成实验分别检测经PEI-alginate/siRNA纳米复合物转染后淋巴管内皮祖细胞的活性、增殖细胞数目、迁移细胞数目以及毛细淋巴管样结构的长度和面积的变化。[结果]经流式细胞仪分析结果VEGFR-3+CD34+细胞占单个核细胞的0.7%,VEGFR-3+CD133+细胞占单个核细胞的0.49%。免疫细胞化学染色显示在VEGFR-3+细胞的细胞膜上有CD34和CD133的表达。刚分离的单个核细胞成圆形或椭圆形,经VEGF-C诱导3天后,大部分细胞开始伸出伪足,细胞呈梭形或多边形,诱导7天后,细胞成簇分布,细胞呈长梭形,细胞量增多,体积增大。水化法制备的PEI-alginate纳米粒经粒度分析仪及扫描电镜检测其粒径及电荷均符合纳米粒载体的基本条件。纳米粒转染效率约84%。随着纳米粒转染载体中PEI量的增加,纳米粒所携带的VEGFR-3siRNA的量增多。当N/P增至8时,溶液中的VEGFR-3siRNA几乎完全与PEI-alginate纳米粒结合形成PEI-alginate/siRNA纳米复合物。用不同N/P比值的纳米复合物转染细胞后,细胞的活性逐渐降低,当N/P=16时,细胞活性与对照组相比具有统计学意义。综合考虑N/P为16为合适比例,以此比例制备的纳米复合物进行后续实验。将制备的纳米粒复合物转染细胞,透射电镜结果显示转染2h后,纳米复合物主要结合在细胞膜表面或刚进入细胞质；转染4h时,大部分的复合物已经进入细胞质,小部分纳米粒开始降解；转染6h时,大部分纳米复合物在细胞质中降解为较小的颗粒。根据目的基因合成的不同VEGFR-3siRNA与PEI-alginate纳米粒制备成纳米复合物,然后用这些不同的纳米粒复合物转染LEPCs, RT-PCR结果显示用第1段siRNA制备的纳米复合物转染LEPCs后VEGFR-3mRNA的表达最低,所以选此纳米复合物进行后续的实验。用藻酸盐修饰的PEI纳米粒处理细胞,细胞活性明显高于未经修饰的PEI。跨膜迁移结果显示纳米粒经siRNA干扰的细胞迁移能力减弱。增殖细胞核抗原染色结果发现经纳米粒处理的细胞荧光强度减弱。Matrigel凝胶内毛细淋巴管样结构形成实验显示、WEGF-C组毛细淋巴管样结构的长度及面积明显高于对照组,而VEGFR-3siRNA抑制后毛细淋巴管样结构长度和面积明显小于VEGF-C组。[结论]PEI-alginate纳米粒作为VEGFR-3siRNA的转运载体,可将VEGFR-3siRNA高效的转入LEPCs。经PEI-alginate/siRNA纳米复合物转染的LEPCs活性和迁移能力下降,增殖数目及毛细淋巴管样结构的长度和面积均减小。这为临床上用VEGFR-3siRNA干扰淋巴管内皮祖细胞的方法抑制肿瘤的淋巴管新生及淋巴转移提供了有力的实验依据。