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肌肉发生(Myogenesis)是当今发育生物学研究的热点领域之一.在肌肉发生过程中,多种调控因子(Myogenic Regulatory Factors,MRFs)的时空特异性表达决定着成肌细胞的一系列的增殖、迁移与分化等重要生物学活动.肌肉抑制素(Myostatin)为各物种间极保守的TGF-β超家族新成员,具有特异性地抑制肌肉发生的作用.研究发现,Myostatin基因敲除小鼠以及Myostatin基因突变牛的骨骼肌组织发生肥大与增生,从而导致其骨骼肌重量增加2~3倍.但人们对Myostatin的作用机制仍知之甚少.为了深入阐明Myostatin影响肌肉发生的机制,我们表达并纯化了Myostatin重组蛋白并制备了抗体.研究了重组Myostatin蛋白对鸡胚成肌细胞(CEM)和小鼠C<,2>C<,12>成肌细胞增殖与分化的作用.实验结果表明,Myostatin对于成肌细胞的增殖过程具有极强的抑制作用,主要表现为抑制细胞周期由G1期向S期的过渡,细胞生长速度显著变慢,细胞周期蛋白Cyclin D1表达下调;同时Myostatin也能够抑制成肌细胞分化为多核的融合肌管细胞,抑制骨骼肌分化标志myogenin和MHC的表达.由重组蛋白制备的抗体能够特异性地识别人、小鼠、大鼠和鸡骨骼肌组织的内源Myostatin蛋白.筛选受Myostatin调控的下游靶基因,可以帮助理解Myostatin引发细胞生物学效应的分子机制.该研究利用DD-PCR的方法在CEM细胞中筛选得到52条受Myostatin调控的基因片段,通过Northern blot排除假阳性后得到20个可能受Myostatin调控的靶基因,其中受Myostatin上调的8个,下调的12个.Myostatin可以降低肌酸激酶(MCK)、肌钙蛋白C(Troponin C)和MRLC的表达,这一结果表明Myostatin是骨骼肌分化的负调控因子.另外,对其它靶基因的鉴定(如:C-RZF、CARP和Nr-13等)和初步研究结果表明,诸如泛素依赖性蛋白降解途径、辅助因子参与的转录调控、细胞凋亡等可能与Myostatin对肌肉发生的抑制作用有关.采用Western blot的方法分析了Myostatin对MAPK信号通路的影响.结果表明:Myostatin可以激活Raf-MEK-Erk1/2 MAPK信号通路,并引起下游转录因子p90RSK和Elk-1被磷酸化而激活.Myostatin对Erk1/2 MAPK通路的激活可以被MEK的特异性抑制剂PD98059所阻断.Myostatin可以轻微激活JNK通路并轻微抑制p38 MAPK和PI3K-Akt通路.钙调磷酸酶Calcineurin信号通路对于T淋巴细胞的激活、心肌肥大、骨骼肌纤维类型转换、离子通道的改变等都具有重要的调节作用.该研究也考察了Myostatin对于Calcineurin-NFAT/MEF2通路的影响.在C<,2>C<,12>细胞中,Myostatin能够抑制钙调磷酸酶Calcineurin的活性,并导致其下游转录因子NFAT c1和MEF2的亚细胞定位由细胞核转移至细胞质中,最终强烈下调了二者的转录激活活性.以上结果表明:Calcineurin信号通路参与了Myostatin对肌肉发生的抑制效应.综上所述,Myostatin正是通过影响细胞内复杂的信号传导通路以及调节靶基因的表达等多种分子机制来实现抑制肌肉发生的作用.