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L-瓜氨酸(L-Citrulline,L-Cit)有很多重要的生理功效,例如提高人体免疫力、吸收体内自由基、辅助治疗风湿关节炎等功能。因而,瓜氨酸逐渐被应用于食品添加剂、保健食品、营养强化剂以及化妆品中。生物合成法生产瓜氨酸是指L-精氨酸在适宜的酶反应条件下被精氨酸脱亚胺酶催化转化为L-瓜氨酸。生物合成法具有转化条件温和、产物浓度高、纯化步骤少等优点。但是,目前对于生物合成法生产L-瓜氨酸的研究仍处于初级阶段。因此,本文主要研究了粪肠球菌Enterococcus faecalis SK32.001发酵生产精氨酸脱亚胺酶的最适条件、精氨酸脱亚胺酶的分离纯化和酶学性质以及溶析结晶产瓜氨酸的最适条件。首先,以产精氨酸脱亚胺酶的粪肠球菌SK32.001为出发菌株,在摇瓶培养的基础上,建立3 L发酵罐产精氨酸脱亚胺酶的发酵工艺。从溶氧量、p H、葡萄糖补料时间、葡萄糖补料策略、精氨酸诱导时机和精氨酸浓度方面进行产酶优化。确定其发酵工艺条件为:溶氧量20%;p H 5.8(1~10 h),6.3(10~18 h);葡萄糖补加时间为接种后12 h,即葡萄糖浓度为4 g/L时;葡萄糖补料策略为以0.42 m L/min的速率恒流速补加100 g/L葡萄糖4 h;精氨酸的诱导时间为发酵8 h时,精氨酸浓度为12 g/L;发酵时间为18 h。在优化条件下,菌体OD600值由2.30提高至6.99,精氨酸脱亚胺酶酶活由1.43 U/m L提高至3.76 U/m L。其次,在分离粪肠球菌SK32.001生产的精氨酸脱亚胺酶后,研究电泳纯度的精氨酸脱亚胺酶的酶学性质。纯化方法包括硫酸铵沉淀、Hi Prep Q FF 16/10离子交换柱层析、Sephadex G-75凝胶柱层析,最后得到分子量约为42 k Da的电泳纯度酶。精氨酸脱亚胺酶的酶活力在温度为50oC和p H为6.5时最高。温度对酶活力影响较大,30~40oC条件下酶活较稳定;p H对酶活力影响较小,p H 5.5~7.5条件下酶活稳定性较好。1.0 mmol/L的Zn2+对精氨酸脱亚胺酶的酶活促进效果最好,和空白对照相比其酶活提高73.3%。而100 mmol/L的Cu2+对精氨酸脱亚胺酶的酶活抑制作用最显著。在最适反应条件下测量精氨酸脱亚胺酶的Km和Vmax分别为1.33 mmol/L和2.41μmol/min。然后,对全细胞转化得到的L-瓜氨酸转化液纯化结晶,并对瓜氨酸晶体进行表征分析。实验中选择溶析结晶的方法,对瓜氨酸的结晶条件进行优化。实验结果表明,瓜氨酸溶析结晶的最适条件为:溶剂体系水/乙醇,结晶温度40oC,晶种添加量3%,搅拌速率50 r/min,以0.33 m L/min的速率向瓜氨酸饱和水溶液中恒速流加乙醇,直到乙醇所占混合溶剂百分比为80%。最后,用高效液相色谱、红外光谱、核磁共振、扫描电子显微镜等方法对结晶产物瓜氨酸进行测试表征。结果表明,溶析结晶所得产物是目的产物L-瓜氨酸,其纯度大于99%。通过扫描电子显微镜观察可知,瓜氨酸晶体外观形状为棒状,表面光滑,形状较为均一。