甜菜(Beta Vulgaris L．)是世界上重要的糖料作物。但由于甜菜块根根重(吨／公顷)和根中含糖(％)呈负相关，通过常规育种途径很难育出根重与糖分之间平衡最佳的品种。前人的研究结果表明蔗糖磷酸合成酶(SPS)在碳分配中起着关键的作用。 近年来基因工程在品种改良方面取得了重大的进展。由于可控性强，效率高，周期短，成本低，并且可以利用远缘的基因资源。因此，基因工程将成为新品种选育的一条全新而有效的途径。从优良作物品种中克隆有益基因，进行遗传转化，进而培育出优质新品种(系)已成为现代分子育种发展的方向。 在甜菜的遗传转化方面，甜菜植株再生系统的建立极其困难，遗传转化效率低，重复性差。本研究是通过RT-PCR，将玉米的蔗糖磷酸合成酶(SPS)基因克隆出来，构建重组质粒，分别利用农杆菌介导法和基因枪轰击法将目的基因导入甜菜，并探讨了影响植株再生和遗传转化效率的因子，建立了稳定的甜菜植株再生和遗传转化体系，获得转SPS基因的甜菜植株，为甜菜高生产力分子育种提供了基础材料和理论依据。主要研究结果如下： 1．利用RT-PCR方法从玉米幼苗叶片总RNA中克隆出玉米的蔗糖磷酸合成酶(SPS)基因的全长cDNA片段。该片段与文献报道的序列具有99％的同源性。 2．确定了在50ul PCR反应体系中10mM MgCl2加入1.0ul时，其高保真Taq DNA聚合酶活性最大。 3．分别构建了以CaMV35S为启动子，以Tnos为终止子的植物双元表达载体PBISPS和以Pcab为启动子，以T35S为终止子的植物表达载体PBSPS，通过农杆菌介导的方法和基因枪法对经过预培养的甜菜叶柄进行遗传转化。其中PBISPS含有NPTⅡ选择标记基因，PBSPS不含选择标记基因。 4．建立了甜菜叶柄器官发生再生系统： a．最佳甜菜种子灭菌剂组合为浓硫酸、70％乙醇、3％次氯酸纳、0.1％升汞。 b．最佳丛生芽诱导分化培养基为MS+IBA0.1mg／l+BA1.0mg／l+30g／l蔗糖+9g／l琼脂粉，PH5.8。 c．最佳丛生芽诱导外植体为经过30天左右预培养的甜菜叶柄。 东北农业大学农学博士学位论文 d．在12个供试的基因型中筛选出4个丛生芽诱导率高的甜菜品种（系），其中忌gi0A 和8908B丛生芽诱导率为引．6％，每个外植体上丛生芽数为4．7个；8910B和新 双8．3．2丛生芽诱导率为48．3％，每个外植体上丛生芽数为5．7个。 e．首次将完全展开叶片的丛生芽甜菜叶柄作为新的外植体诱导丛生芽分化．5．优化了农杆菌介导的经过预培养的甜菜叶柄遗传转化体系： a8910AB、8908B在0．8 OD600菌液浓度的农杆菌侵染8分钟获得最高的抗性芽 率，其抗性芽率分别为36．6％、36．6％和33．3％。而对于材料新双8－3－2在1．0 ODm 菌液浓度的农杆菌侵染6分钟获得最高的抗性芽率，其抗性芽率为40．0％。 b确定了最佳的共培养温度为22－25℃。 C．丛生芽分化阶段卡那霉素的选择压力确定为150mg／L；丛生芽生根阶段卡那霉素 的选择压力 8910AB和 5908B确定为 20mz／L，新双 8－3－2为 25ms／L。 d．在丛生芽分化阶段采用延迟选择法；在抗性芽筛选阶段采用两步选择法即丛生芽 诱导分化阶段和丛生芽生根阶段都进行筛选。6．国内外首次用农杆菌介导的方法对经过预培养的甜菜叶柄进行遗传转化并获得整合 玉米的蔗糖磷酸合成酶（SPS）基因的转基因甜菜，共4株，阳性植株比率为40％， 整合比率为100％．其中，8910B有2株，8910A有1株，8908B有1株。7．国内首次用基因枪法对经过预培养的甜菜叶柄进行遗传转化获得整合玉米的蔗糖磷 酸合成酶（SPS）基因的转基因甜菜，共3株，阳性植株比率为0．76％，整合比率为 100ng中：8910B有1株，新双M－2有2株。