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背景白内障是由于眼球晶状体的部分或全部浑浊化所导致的视力下降。可分为早发型（先天性）白内障和遗传性白内障。先天性白内障是指出生后一年内出现的晶状体浑浊，是儿童视力丧失的主要原因之一。先天性白内障的遗传方式有常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传和X连锁隐性遗传等，其中以常染色体显性遗传性先天性白内障（ADCC）为主。到目前为止，通过对一系列ADCC家族进行基因连锁分析，对先天性白内障的遗传背景有了更加详细的了解，约有40多个遗传位点和常染色体显性先天性白内障有关，按照其编码蛋白功能，与人类ADCC有关的基因分一下四类：晶状体蛋白基因，转录调节因子基因，细胞骨架蛋白基因和膜转运蛋白基因。其中转录调节因子基因中的HSF4有很重要的作用，对其研究亦有所进步，它在晶状体纤维细胞的生长和成熟等过程中起着重要作用，但是其转录调控的机制还不清楚。近年来发现与白内障有关的突变位点的数量已超过100个。在人体内，通过对一系列ADCC家族进行基因连锁分析发现均存在HSF4b基因的错义突变。在小鼠，通过转基因技术敲除小鼠的HSF4基因，新生小鼠出生后3-5天即出现白内障，可能与晶状体纤维细胞分化和发育异常有关。HSF4是HSFs即热休克转录因子家族的一个成员，它在外界和内环境等的刺激或者正常生理状态下都可形成三聚体，然后和热休克元件（HSE）结合，激活下游HSP27、HSP70、HSP90以及晶状体蛋白等的表达。HSF4分两不同亚型：HSF4a和HSF4b。前者有转录抑制活性，而后者具有转录激活和抑制双重作用。HSF4b是晶状体内特异表达的亚型。小鼠晶状体HSF4b的缺失降低Hsp25，γ-crystallin和CP49等蛋白的表达。磷酸化是蛋白质最重要的翻译后修饰之一，在细胞信号的传递过程中占有极其重要的地位，HSF4b在生理条件下即可处于磷酸化状态，也可以受MAP激酶调控发生磷酸化修饰，即HSF4b受P38、JNK和ERKl/2的磷酸化调控发生磷酸化，磷酸化后激活其下游热休克蛋白表达，磷酸化可诱导HSF4b类泛素化，SUM0反过来抑制了HSF4b体外转录活性。HSF4中含有一个PDSM（磷酸化依赖SUMO化修饰基序）模体，PDSM存在于保守两个功能不同的热休克因子家族成员HSF1和HSF4b中间，与SUMO相似，PDSM通过磷酸化依赖SUMO化，发过来抑制了底物的转录活性。HSF4b中的S299丝氨酸处于PDSM模体PASP中，因此我们推测该位点磷酸化后能反过来抑制HSF4b的转录活性。14-3-3与靶蛋白结合时主要通过识别靶蛋白中的磷酸化丝氨酸/苏氨酸识别序列。根据这些序列模体可以推测某些蛋白质能否和14-3-3蛋白结合，S299位点存在含有丝氨酸的模体，我们猜测它是否与14-3-3相互作用。下一步实验既是利用三个突变体分别与14-3-3共转染观察它们的结合作用，结合下游蛋白的表达量来分析该位点磷酸化后对HSF4b的转录活性调节。为了进一步了解控制HSF4b转录活性的分子机制，我们就磷酸化调控HSF4b的机制进行探讨，预测可能的蛋白序列磷酸化位点,将其定点突变进行功能研究和机制研究，找到相应的磷酸化激酶和通路。本实验通过构建HSF4b的突变体，测定HSF4b的转录活性，确定有效的磷酸化位点以及对下游相关基因的调控。目的本研究通过构建HSF4b的突变体，测定HSF4b的转录活性，确定有效的磷酸化位点以及HSF4b下游相关基因的调控。方法1.应用PCR技术，利用突变引物扩增PWZL-blast-HSF4b(以下简称HSF4b)，产物用DpnⅠ酶切，转化至DH5α中，提取质粒，ECORⅠ初步酶切鉴定，测序。2.测序证确后，将上述突变质粒转染293T细胞，进行真核表达。利用SDS-PAGE和Western blot实验鉴定HSF4b和Hsp27蛋白的表达，初步确定有效的磷酸化位点。3.利用HSF4b缺失的晶状体上皮细胞（MLEC-/-），转染突变体质粒，建立稳定株MLEC HSF4b、MLEC HSF4b/S299A、MLEC HSF4b/S299D和MLEC HSF4b/S299E。Western blot实验鉴定HSF4b和Hsp27，alpha B-crystallin等蛋白的表达。4.通过luciferase assay实验，来验证HSF4b/S299A,HSF4b/S299D, HSF4b/S299E对下游基因α B-晶体蛋白（alpha B-crystallin）的影响。结果1.构建了HSF4b的突变质粒HSF4b/S42A、HSF4b/S49A、HSF4b/S66A、HSF4b/S85A、HSF4b/T173A、HSF4b/T221A、HSF4b/S243A、HSF4b/S269A、HSF4b/S278A、HSF4b/S299A、HSF4b/S340A、HSF4b/S372A、HSF4b/S401A、HSF4b/T446A、HSF4b/T471A、HSF4b/S489A、HSF4b/S299D和HSF4b/S299E共18个，测序正确。2.将上述突变质粒转染293T细胞，Western blot实验鉴定体内Hsp27蛋白的表达结果显示：HSF4b/S66、AHSF4b/S269A、HSF4b/T446A、HSF4b/T471A的Hsp27表达降低，HSF4b/S299A的Hsp27表达升高，其他突变体无明显变化。3.成功建立了稳定株MLEC/HSF4b、MLEC/HSF4b/S299A、MLEC/HSF4b/S299D和MLEC/HSF4b/S299E三个，Western blot实验证明S299是有效的磷酸化位点，起到了表达抑制作用。4. Luciferase assay说明了S299A对HSF4b下游αB-晶体蛋白（alpha B-crystallin）有转录激活作用，HSF4b/S299D和HSF4b/S299E对HSF4b下游基因alpha B-crystallin有转录抑制作用。结论1.成功建立了HSF4b表达突变体18个。2.初步确定了5个有效磷酸化位点，其中HSF4b/S66A、HSF4b/S269A、HSF4b/T446A、HSF4b/T471A表现为对下游基因的转录激活作用，HSF4b/S299A表现为转录抑制作用。