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背景:动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是心脑血管疾病和外周血管性疾病的主要病理学基础,在西方发达国家是重要致死因素,近年来随着生活水平的提高,也逐渐成为我国中老年人群的主要死亡原因之一。目前AS的发病机制尚未完全阐明,大量临床和基础研究表明,AS是一种慢性炎症性疾病,包括CD4+T淋巴细胞在内的多种免疫细胞和细胞因子参与其中。Th9细胞是一种新发现的CD4+T淋巴细胞亚群,初始CD4+T细胞受到抗原刺激后在转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)和白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)的作用下可分化为Th9细胞并分泌大量的IL-9,其产生和功能受转录因子PU.1调控。研究发现Th9细胞参与调节哮喘和炎症性肠病等多种炎症性疾病的发生,但当前Th9细胞在AS进程中作用研究甚少。Thl7细胞也是近年来发现的一种CD4+T淋巴细胞亚型,具有很强的促炎作用,与多种自身免疫病的发生发展有关。研究证实Th17细胞发挥促AS作用。泡沫细胞是AS形成的重要病理学基础,氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)可促进泡沫细胞形成,与AS的发生密切相关。本研究通过复制AS模型,分析Th9/IL-9的表达变化及其与Th17/IL-17、ox-LDL的相关性,并通过体内干预实验与细胞实验进一步明确Th9/IL-9在AS进程中的作用,并初步探讨其机制,为防治AS提供新的靶点。目的:探讨CD4+IL-9+T细胞(Th9)和IL-9在Apo E-/-小鼠动脉粥样硬化模型中表达变化及意义,并初步探讨其机制。方法:(1)高脂喂养复制Apo E-/-小鼠AS模型,通过检测各种指标分析Th9/IL-9在实验性动脉粥样硬化进程中的作用和意义。(1)48只雄性8周龄Apo E-/-小鼠高脂饲料喂养,同周龄C57BL/6对照小鼠普通饲料喂养,分别饲养0周(0w)、4w、12w和24w后处死;(2)分别留取不同周龄小鼠血清检测血脂的变化:(3)取不同周龄小鼠的主动脉制备石蜡切片,HE染色观察小鼠主动脉斑块形成情况;(4)流式细胞术检测不同周龄小鼠脾脏Th9细胞和Th17细胞表达率的变化;(5)酶联免疫吸附法(enzyme-linked immune-sorbent assay,ELISA)法检测不同周龄小鼠血清IL-9、IL-17和ox-LDL浓度变化;(6)逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain recation,RT-PCR)法检测不同周龄小鼠的脾脏和主动脉斑块中PU.1和RORγt m RNA表达水平变化。(2)通过Apo E-/-小鼠体内干预实验,分析重组IL-9(r IL-9)蛋白和IL-9单克隆抗体(IL-9m Ab)对AS发生发展的影响。(1)Apo E-/-小鼠15只,随机分为3组,分别是PBS对照组、r IL-9干预组和IL-9m Ab干预组,从8周龄开始尾静脉注射,每周一次,连续12周;(2)HE染色检测主动脉斑块大小,ELISA法检测血清IL-9浓度。(3)泡沫细胞诱导实验探讨Th9/IL-9在AS进程中的作用机制。(1)收集C57BL/6小鼠腹腔巨噬细胞并贴壁培养;(2)将腹腔巨噬细胞分为3组,分别是对照组、ox-LDL诱导组和r IL-9干预组,培养3天后进行油红染色,观察泡沫细胞形成情况。结果:(1)血脂检测显示随着饲养时间延长,Apo E-/-小鼠总胆固醇(total cholesterol,TC)和甘油三酯(triglyceride,TG)水平呈升高趋势,高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)水平不断降低,同周龄C57BL/6小鼠血脂水平无显著变化。Apo E-/-小鼠高脂饲养4w时,主动脉仅出现增厚,12w时,主动脉出现斑块,24w时,斑块面积显著增大,与12w相比,差异有统计学意义(P<0.01),而同周龄C57BL/6小鼠在整个饲养过程中主动脉并无明显增厚或者斑块形成。(2)高脂饲养4w起,Apo E-/-小鼠Th9细胞和Th17细胞表达率均高于同周龄C57BL/6小鼠(P<0.01),且随着饲养周龄的延长,Th9细胞和Th17细胞表达率均明显升高。24w时,Th9细胞表达率显著高于12w(P<0.01),而Th17细胞表达率虽然增高,但与12w比较无明显差异。(3)高脂饲养4w起,Apo E-/-小鼠血清IL-9、IL-17和ox-LDL浓度均高于同周龄C57BL/6小鼠,且随着饲养周龄的延长,IL-9、IL-17和ox-LDL浓度不断增加。24w时,IL-9浓度达最高,而IL-17浓度在12w时达到最高。(4)Apo E-/-小鼠血清IL-9浓度和脾脏Th9细胞表达率与血清ox-LDL、IL-17浓度及脾脏Th17表达率均呈显著正相关(均P<0.01)。(5)高脂饲养4w起,Apo E-/-小鼠脾脏和主动脉组织中PU.1和RORγt的表达水平均高于同周龄C57BL/6小鼠(均P<0.01),随着饲养周龄的延长,PU.1和RORγt的表达水平不断升高。(6)Apo E-/-小鼠在进行r IL-9干预后,其主动脉斑块面积、血清IL-9浓度与PBS对照组相比均显著增大,而在进行IL-9m Ab干预后,其主动脉斑块面积、血清IL-9浓度与PBS对照组相比明显减小。(7)r IL-9干预组诱导生成的泡沫细胞较ox-LDL诱导组明显增多。结论:(1)随着饲养周龄的延长,Apo E-/-小鼠动脉斑块形成和发展,同时Th9/IL-9和Th17/IL-17表达亦明显升高;Th9/IL-9在AS斑块形成的整个进程均呈显著增高趋势,而Th17/IL-17水平增高则主要发生在AS斑块形成早期。(2)Th9/IL-9与重要促AS因子ox-LDL及Th17/IL-17表达均呈显著正相关;(3)体内干预实验证实,r IL-9可明显促进AS斑块生成,而IL-9m Ab可抑制AS发生发展。(4)IL-9可促进ox-LDL诱导的泡沫细胞生成。因此,Th9/IL-9在AS进程中的作用与其影响Th17/IL-17表达及促进泡沫细胞生成有关。