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目的：根据临床流行病学资料和我们多年来的实验病理学观察，认为成骨活跃和骨转换加速是氟骨症进展期的重要特征和形成骨病变多样性的病理基础，膳食低钙是氟骨症的主要促发和加重因素，整体低钙—甲旁腺素（PTH）分泌增多—靶细胞内Ca2+升高这种“钙矛盾”（Calcium paradox）参与了氟骨症的发病机制。但其确切作用机理尚不明确。甲旁腺素相关肽（PTH-rp）具有明显的PTH活性，在人体骨微环境中扮演重要角色，对先天骨发育和后天骨的代谢均有重要作用，在生理和病理状态下调控靶细胞的增殖和分化。成骨细胞自身可以合成PTH-rp及其受体，以自分泌和旁分泌方式在骨形成过程中发挥重要作用。鉴于迄今氟骨症发病机制研究中尚未深入涉及PTH-rp，因而是本项目研究的重点内容之一。钙敏感受体（calcium sensing receptor，CaSR)属于G蛋白偶联受体家族，广泛分布于甲状旁腺、甲状腺C细胞、肾脏、骨和肠等组织，在维持机体钙稳态，调节细胞生长、分化和凋亡方面起重要作用。有实验表明，CaSR对成骨细胞分化和甲状旁腺功能均有重要作用。在研究氟骨症骨转换增强发生机制的过程中，CaSR的作用值得关注，但有关这一方面迄今尚未见报道。因此也作为本研究重点探讨内容。本课题将通过氟中毒动物模型和体外成骨细胞染氟，观察氟对动物血清和体外细胞培养上清钙离子浓度、骨组织和成骨细胞中PTH、PTH-rp的mRNA和蛋白表达，探讨PTH、PTH-rp在促进成骨细胞功能活跃和骨转换增强中的分子机制；同时，观察CaSR在染氟成骨细胞中的变化并探讨其可能作用。方法：分为体内和体外两部分进行。体内部分：将40只SD大鼠按体重分为四组，每组10只。适应性喂养一周后，利用富钙平衡饲料和低钙偏食饲料饲养大鼠,并经饮水投氟(分析纯NaF)复制氟中毒模型每日更换食水,实验期限为2个月。具体分组和实验处理因素如下表：表1实验动物分组及处理因素实验期末检测氟中毒大鼠血清中钙离子浓度,骨组织中PTH、PTh-rp、CaSR, CPG、RANKL等的mRNA和蛋白表达;体外部分：应用成骨细胞株(MC3T3-E1)。实验处理因素如下表：表2细胞染氟及分组应用CCK-8方法检测细胞增殖活性,生化自动分析仪检测培养液中钙离子浓度,Realtime-PCR和Western Blot法检测PTH, PTH-rp、CaSR mRNA和蛋白的表达量。结果：1.体内实验：1)与富钙平衡对照组(ctrl组)比较,富钙平衡加氟组(G1组)血清钙离子浓度降低;PTH mRNA表达明显降低,蛋白表达明显升高(P<0.01);PTH-rp mRNA及蛋白量均明显降低(P<0.05); CaSR mRNA及蛋白表达明显升高(P<0.05);CT mRNA表达降低,蛋白表达升高(P<0.01);骨组织中OPG, RANKL mRNA及蛋白量、RANKL/OPG mRNA及蛋白比值均有不同程度增加,其中RANKL mRNA和RANKL/OPG mRNA比值明显升高（P<0.01）；2）与偏食低钙对照组（G2组）比较，偏食低钙加氟组（G3组）大鼠血清游离钙离子浓度明显降低； PTH和PTH-rp mRNA及蛋白表达均明显升高(P＜0.01，P＜0.05）；CaSR mRNA及蛋白表达明显升高(P＜0.01，P＜0.05）；CT mRNA和蛋白表达明显降低(P＜0.01）；OPG mRNA表达明显升高（P<0.01）；RANKLmRNA明显下降，RANKL/OPG mRNA比值明显下降；与G2组比较，G3组OPG蛋白表达明显升高，RANKL蛋白表达稍有升高，RANKL/OPG蛋白比值明显下降。2.体外实验：1）与对照组（C组）相比，F2组细胞上清液中游离钙离子浓度明显升高（P＜0.01），F5、F10组钙离子浓度明显降低（P＜0.05， P＜0.01）；2）本实验中较低浓度氟（2mg/L F-、5mg/L F-）可刺激细胞活性，而高剂量氟（10mg/L F-）则抑制细胞活性；3）与C组相比，F2、F5组细胞PTH、PTH-rp mRNA及蛋白量均明显降低，F10组明显升高（P＜0.05）；4）与C比较，染氟各组细胞CT mRNA及蛋白降低；CaSR mRNA及蛋白量增加（P＜0.05， P＜0.01）。结论：1.细胞外钙离子浓度与染氟浓度密切相关；2.氟对成骨细胞的作用具有剂量依赖关系；3.氟作用下，无论是体内或体外，PTH、PTH-rp mRNA、蛋白表达均发生明显波动；其中在体内除富钙平衡膳食组PTH蛋白呈增强效应外，其他均以明显抑制为主；高剂量染氟（10mg/LF-）成骨细胞中PTH、PTH-rp mRNA和蛋白均呈高表达状态（P＜0.01）；4.氟中毒动物骨组织和染氟成骨细胞中CaSR mRNA、蛋白表达量均明显增加；5.体内、体外CT基因的表达均受氟的抑制，蛋白的表达则体内外表现有差异，其原因有待探索；6. OPGL/OPG mRNA和蛋白表达和比值在富钙平衡氟中毒大鼠骨组织和偏食低钙氟中毒大鼠骨组织中的表达结果差异很大，前者明显升高，后者结果相反。上述结果提示一定剂量的氟无论在体内或体外均可导致PTH和PTH-rp产生明显波动，这种变化在体内既受膳食中钙含量的影响，也和体内复杂代谢网络调节有关，但总的趋势是氟可导致PTH和PTH-rp表达明显增强，进一步证明整体低钙刺激PTH分泌增多以及后来的一系列变化在氟中毒发生机制中的重要地位；氟在体内和体外对CaSR表达的明显刺激作用进一步提示在氟骨症发生机制中，即整体低钙—PTH分泌增多—成骨细胞内Ca2+升高过程中，CaSR可能地位举足轻重。氟对CT的抑制以及对RANKL/OPG mRNA比值的刺激或抑制作用进一步证明氟对骨转换的重要作用以及膳食低钙状态在氟中毒发生中的协同效应。