油菜杂种优势显著,化学杀雄已成为油菜杂种优势利用的有效途径之一。已有研究发现少数几种磺酰脲类除草剂在低浓度时可以作为化学杀雄剂用于油菜杂交育种;但迄今关于化学杂交剂(Chemical Hybridization Agent,CHA)诱导植物雄性不育的机理却知之甚少,这严重阻碍化学杀雄技术的应用以及新的杀雄剂的开发。为揭示本课题组新近开发的CHA-单嘧磺酯钠(Monosulfuron Ester Sodium,MES)诱导甘蓝型油菜雄性不育的分子机理,本研究首先观察了对照可育组和CHA-MES诱导不育组花药绒毡层细胞和花粉母细胞的超微结构变化;然后利用油菜表达谱芯片技术分析了正常情况下油菜花药发育过程中转录组的变化情况;同时对可育和不育花药的差异转录组进行了分析,筛选出一系列不育相关候选基因;最后利用病毒介导的基因沉默技术在拟南芥植株上验证候选基因与植物育性之间的关系。主要研究结果如下:1.通过对正常可育和CHA-MES诱导不育花药细胞的超微结构观察发现:在花粉母细胞时期,可育花药中多层细胞开始分化形成,绒毡层细胞和花粉母细胞保持着高度的分裂性;而MES诱导不育花药中,花粉母细胞则出现异常的细胞质壁分离现象。伴随着发育的进行,可育花药进入四分体时期,小孢子初级花粉外壁结构开始形成,同时伴随着绒毡层细胞向分泌型转化,出现大量的内质网结构;MES诱导不育花药中,多数细胞无法正常进行减数分裂,仅能观察到彼此分离的严重质壁分离的性母细胞。单核花粉粒时期,可育小孢子中形成一个大液泡以及丰富的细胞器结构,绒毡层细胞壁降解,细胞质融合,出现两种特殊的质体结构(造油体和绒毡层小体),向小孢子堆叠,进一步加固花粉外壁结构;MES诱导不育花药中,少量的细胞通过四分体时期进入单核花粉粒时期,但花粉粒中几乎无内容物,有的无法形成完整的花粉外壁。而绒毡层细胞也出现多种结构异常,如细胞壁不降解,细胞质无法融合;细胞质融合但不降解;造油体和绒毡层小体结构异常等等。成熟花粉粒时期,正常可育的二核或三核花粉粒中可见许多颗粒状的储存物质及丰富的内质网结构;而MES诱导不育花药中,花粉彻底败育,花粉粒空秕无内容物,绒毡层细胞残留物呈凝固块状,或为仍保留细胞壁的死细胞。此外,单核花粉粒时期的不育花药外皮层和内皮层中叶绿体结构也出现异常现象。因此,正常的油菜花药发育过程涉及到多种细胞和细胞器的参与,而CHA-MES处理则导致花粉母细胞、绒毡层细胞、以及药壁细胞的结构受到不同程度的破坏,尤其体现在质体结构的异常方面。2.通过对油菜正常可育植株叶片及不同发育阶段花药的转录组进行分析发现:在油菜花药发育过程中存在广泛的基因表达量的动态变化过程。通过对三个花药组织与叶片的比较,以及花药组织之间的两两比较,共筛选到11,678个差异表达转录本(differentiallyexpressedtranscripts,dets)。从这些dets的分布来看,在花药发育早期,dets数目较少,但其表达水平变化幅度较大,而后期,涉及到大量基因的转录水平调整。使用kmeans聚类方法将11,678个dets根据其在四个组织中的表达变化情况分成15种不同的表达模式(dominantpatterns,dps),每个dp中包含89到4319个dets。其中,dp1-dp5包含705个转录本,表现为在花药发育早期(sbs和an-mbs)时高表达,而dp6-dp12中包含的1,517个转录本在晚期花药(an-lbs)中高表达。对各dp中的转录本进行基因功能的go富集分析发现,与内膜系统相关的基因在花药发育早期和晚期均有富集(dp1,dp5,dp6,dp8,dp9)。此外,在花药发育早期(dp1-dp5),与花粉外壁形成和丙三醇代谢相关的基因被富集;而花药发育晚期(dp6-dp12),大量与细胞壁或果胶代谢相关的基因被富集。15个dp中涉及到的脂肪酸以及碳水化合物代谢相关基因分布情况显示,脂肪酸代谢相关基因主要在花药发育早期富集,而碳水化合物代谢相关基因则在后期富集。3.对正常可育和cha-mes诱导不育植株叶片及花药组织进行差异转录组分析:共筛选到1,501个受cha-mes影响的与油菜花药发育相关的dets,其中64%的dets在不育株中下调表达,36%上调表达。并且叶片(ls)和小花蕾(sbs)中检测到的dets数目较少(分别为77和67个);而中后期花蕾的花药(an-mbs和an-lbs)中则检测到相对较多的dets(161和1,238)。利用拟南芥同源基因对以上dets进行了功能注释。亚细胞定位分析发现大部分差异表达基因分布于质体/叶绿体、线粒体和细胞核中。基因功能分类和富集分析发现cha-mes处理主要影响了花药发育过程中与碳水化合物和脂肪酸代谢相关基因的表达。利用mapman软件进行的代谢途径分析也证实了以上结果。结合基因功能富集和代谢途径分析,筛选到了一系列与脂肪酸和碳水化合物代谢相关的差异表达基因,推测其可能与mes诱导油菜雄性不育紧密相关。最后,可育和不育植株叶片和花蕾中糖类物质含量的变化进一步证实了cha-mes处理的确影响了叶片和花蕾中碳水化合物的代谢。4.虽然有报道称磺酰脲类除草剂的作用靶标是乙酰乳酸合成酶(acetolactatesynthase,als),但该类除草剂作为杀雄剂使用时的基本作用机理尚未见报道。本研究利用拟南芥抗磺酰脲类除草剂突变体cs204为材料,验证了cha-mes诱导植物雄性不育的作用靶标同为als酶。同时,利用trv病毒介导的基因沉默体系(trv-vigs)干扰拟南芥植株体内的als基因表达,也可以获得雄性不育株,且随着als基因表达量下降程度的增加,植株出现严重的发育障碍。这与化学杀雄剂对植物生长发育的影响是相似的,即低浓度下诱导雄性不育,高浓度下严重抑制生长。此外,通过差异转录组分析我们得到了一系列可能与花药育性相关的基因,根据它们的表达情况及所涉及的功能,挑选了42个作为候选基因。利用TRV-VIGS技术在拟南芥中快速筛选与植物育性相关的基因,发现了2个可能与植物育性相关的基因。综上,本研究提出CHA-MES诱导甘蓝型油菜雄性不育的初步机理为:MES药物处理首先抑制了花药中ALS酶的活性,影响了植株花药中与碳水化合物和脂肪酸代谢相关基因的表达,导致油菜中精细代谢调控网络发生重排,质体及其他细胞器结构异常,最终导致雄性不育。也许正是因为花药发育对质体以及碳水化合物和脂肪酸代谢过程的需求程度明显高于其他组织,才造成油菜花药组织对低浓度的MES高度敏感,而其他组织则不敏感。