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目的探讨小鼠肺成纤维细胞内钙稳态失衡时Ⅰ型胶原蛋白的表达以及肺成纤维细胞凋亡情况,本研究使用钙离子拮抗剂-粉防己碱(Tetrandrine,Tet)和肌浆网钙泵抑制剂-毒胡萝卜素(Thapsigargin,TG)体外作用小鼠肺成纤维细胞,观察钙离子(Ca2+)失衡时,内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)指标和细胞凋亡情况,从ERS途径探讨细胞凋亡信号通路,阐明Ca2+、ERS、细胞凋亡的作用机理,为临床上防治肺纤维化疾病提供理论依据。方法液氮冻存的小鼠肺成纤维细胞,放入37℃恒温水浴箱内进行融化,快速接种于刚配置好的完全培养基内,放置于5%CO2、37℃恒温孵育箱内,定期通过倒置相差显微镜观察培养瓶内细胞生长情况,经常规的换液、传代培养和同步化。根据MTT检测结果将细胞分为4组,即对照组、转化生长因子-β1(TGF-β1)组、钙离子拮抗剂组、肌浆网钙泵抑制剂组。对照组细胞给予完全培养基,其他3组给予5ng/ml TGF-β1作用24h后,钙离子拮抗剂组和肌浆网钙泵抑制剂组再分别给予5mg/l Tet和4μM TG作用细胞24h。进行扫描电子显微镜观察细胞形态、流式细胞仪检测各组细胞凋亡率和细胞周期比例、激光共聚焦显微镜观察各组细胞内Ca2+水平、Western-blot方法检测Ⅰ型胶原、GRP78、Calpain-2、CHOP,免疫组织细胞化学方法检测caspase-12、caspase-3蛋白表达。结果1细胞形态对照组和TGF-β1组在扫描电子显微镜下观察,细胞膜、细胞核、染色质形态完整,加入钙离子拮抗剂、肌浆网钙泵抑制剂的两组细胞均出现了典型的凋亡形态:细胞浆浓缩、细胞体积缩小、染色质逐渐聚集呈月牙形等。2细胞周期各组间,G1期、S期、G2期变化均有显著性差异(P<0.05);与对照组相比较,加入TGF-β1作用后的细胞的G1期细胞比例降低(P<0.05),S期细胞比例明显增加(P<0.05),G2期细胞比例下降(P<0.05);与TGF-β1组相比较,加入钙离子拮抗剂、肌浆网钙泵抑制剂作用后的细胞,G2期和S期细胞比例均明显减少(P<0.05),G1期比例均明显增加(P<0.05);3细胞凋亡流式细胞仪检测结果发现,对照组、TGF-β1组、钙离子拮抗剂组、肌浆网钙泵抑制剂组的凋亡率分别为6.73%、5.03%、9.60%、21.53%,各组间比较差异显著(P<0.05);钙离子拮抗剂组和肌浆网钙泵抑制剂组凋亡率明显高于对照组和TGF-β1组。4 Ca2+浓度各组间比较差异显著(P<0.05);与对照组相比较,TGF-β1组细胞内荧光度值变化不明显(P>0.05);与TGF-β1组相比较,加入钙离子拮抗剂后,细胞内的荧光度值明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05),但加入肌浆网钙泵抑制剂后,细胞内荧光度值明显升高(P<0.05);5 Western-blot检测结果各组间成纤维细胞内Ⅰ型胶原蛋白、GRP78、CHOP和Calpain-2蛋白的表达均有显著性差异(P<0.05);TGF-β1组的Ⅰ型胶原蛋白表达明显高于对照组(P<0.05),但钙离子拮抗剂组、肌浆网钙泵抑制剂组两组的Ⅰ型胶原蛋白表达显著降低对照组和TGF-β1组(P<0.05)。与对照组相比,TGF-β1组的GRP78和CHOP蛋白表达差异不明显(P>0.05),而钙离子拮抗剂组、肌浆网钙泵抑制剂组两组GRP78和CHOP蛋白表达明显高于对照组和TGF-β1组(P<0.05)。与对照组相比,TGF-β1组和钙离子拮抗剂组的Calpain-2蛋白表达差异不明显(P>0.05),肌浆网钙泵抑制剂组Calpain-2蛋白表达明显升高(P<0.05),而钙离子拮抗剂组的Calpain-2蛋白表达与TGF-β1组比较差异不明显(P>0.05),肌浆网钙泵抑制剂组Calpain-2蛋白表达明显升高(P<0.05);6免疫细胞组织化学检测结果各组间成纤维细胞内caspase-12、caspase-3蛋白表达均有显著性差异(P<0.05);与对照组相比,TGF-β1组的caspase-12、caspase-3蛋白表达差异不明显(P>0.05),钙离子拮抗剂组、肌浆网钙泵抑制剂组两组caspase-12、caspase-3蛋白表达明显升高(P<0.05),与TGF-β1组比较,钙离子拮抗剂组、肌浆网钙泵抑制剂组两组caspase-12、caspase-3蛋白表达均明显升高(P<0.05)。结论1钙离子拮抗剂和肌浆网钙泵抑制剂能改变成纤维细胞周期分布,促进成纤维细胞凋亡。2钙离子拮抗剂和肌浆网钙泵抑制剂可使肺成纤维细胞内Ca2+稳态失衡,诱导ERS,通过ERS凋亡途径促进细胞凋亡,可以阻止肺纤维化进程