鳜ASC和Cathepsin B的功能研究

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鳜是我国重要的鱼类养殖品种,而近年来传染性脾肾坏死病毒(InfectiousSpleen and Kidney Necrosis Virus,ISKNV)对鳜养殖造成了严重的经济损失。为了研究病毒与宿主的相互作用,在ISKNV感染鳜的抑制性消减杂交cDNA文库基础上,经NCBI数据库比对分析后发现凋亡相关点状聚集含CARD蛋白(Apoptosis-associated Speck-like protein containing a CARD,ASC)和组织蛋白酶B(Cathepsin B,CathB)两个表达序列标签(Expression Sequence Tag,EST)。 ASC是一个拥有氨基端PYRIN结构域和羧基端CARD结构域的双结构蛋白,它作为一种调控蛋白,可以通过它所拥有的两个蛋白相互作用结构域去募集与其同源的含有PYRIN和CARD结构域的蛋白,从而参与天然免疫、细胞凋亡等多种信号通路。鳜ASC(mfasc)cDNA全长899bp,编码201aa的蛋白,功能结构预测发现ASC编码蛋白含有氨基端90个氨基酸残基编码的PYRIN和羧基端90个氨基酸残基编码的CARD。mfasc基因全长3954bp,包括有有四个外显子,三个内含子。Nonhem blot分析,mfasc在头肾组织中的表达最高,其次是鳃,后肾,脾和肠,在皮肤和肝中的表达较少。在ISKNV感染鳜过程中,我们分析了mfasc mRNA随病毒感染的表达时相,发现在所检测组织中的mRNA的表达没有发生很明显的变化。我们选取了不表达ASC的人293T细胞来进行mfASC体外功能的研究,发现mfASC全蛋白的表达时,在细胞核周形成点状聚集,当我们单独表达单个功能结构域时,这种聚集现象随即消失。在瞬时转染的2937r细胞中,不论是否用TNFa和LPS刺激,mfASC都能够抑制NF-kB的活性。 CathB是木瓜样半胱氨酸组织蛋白酶的一种,通常定位于溶酶体中,主要行使蛋白降解以维持细胞正常代谢调控的作用,但在多种病理状况下,CathB出现过表达,重新定位和分泌到溶酶体外的现象。鳜CathB(mfcathB)的cDNA序列长度为2129 bp,编码330个氨基酸的蛋白。Northern blot分析发现,mfcathB有两个不同的转录本,在脾脏组织中的表达最高,其次是后肾、头肾、肝脏和肠,在鳃和皮肤中的表达较少,并且在鳃中只能检测到一个转录本。在ISKNV感染鳜过程中,我们分析了mfcathB mRNA随病毒感染的表达时相,发现在所检测组织中的mRNA的表达都有不同程度的升高现象。为了进一步研究mfcathB在虹彩病毒感染过程中所起的作用,我们选择了虎纹蛙病毒(Tiger Frog Virus,TFV)感染FHM细胞的模型进行研究。发现CathB瞬时转染的FHM细胞更容易被TFV病毒感染。通过CathB特异性的抑制剂,抑制FHM细胞内源性CathB酶的活性,发现TFV感染被强烈的抑制。
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