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背景:胰腺癌是致死率极高的恶性肿瘤之一,其中80-90%为胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC）。转移是胰腺癌患者最重要的死亡原因,虽然在放疗、化疗和免疫治疗等领域取得了一系列进展,仍有约90%的胰腺导管腺癌患者死于早期转移,5年生存率仅为7%。上皮-间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）在胰腺癌转移过程中扮演重要的角色。有研究表明EMT是胰腺癌患者预后的独立危险因素,其间质化程度越高,预后越差。更为引人注目的是,在胰腺癌发生、发展的极早期,如:上皮内瘤变和腺泡-导管化生等癌前病变的区域,即可检测到EMT相关标志物的高表达。因此,深入探究EMT过程的调控因素和机制,对于全面理解胰腺癌的转移具有重要意义,并有助于寻获新的抗胰腺癌转移治疗靶点。EMT可视作肿瘤细胞对生长微环境变化的一种适应性调整。既往研究表明,肿瘤细胞代谢重编程可能对EMT表型发挥着重要的调控作用。因此,从调控代谢状态入手,认识肿瘤细胞EMT表型的变化与转换,进而理解胰腺癌的侵袭转移,是一个值得深入探索的方向。乙醛脱氢酶（Aldehyde dehydrogenase,ALDHs）是催化调节内源性醛代谢的关键酶。ALDHs家族包含19个亚型,参与体内多种代谢过程,在多种肿瘤干细胞亚群中高表达,并与肿瘤的侵袭、转移及治疗抵抗密切相关。然而,ALDH家族成员与胰腺癌细胞EMT表型之间的关系尚不明确,尤其是在EMT过程中所起的作用、调控机制及其治疗学意义方面仍待进一步研究。目的:1.分析与胰腺癌EMT基因集富集相关的代谢调控基因。2.探讨ALDH1A3调控胰腺癌侵袭迁移能力及EMT表型的具体机制。3.探讨ALDH1A3与胰腺癌患者临床病理参数及预后的关系。4.筛选ALDH1A3的特异性抑制剂并评估其对胰腺癌转移的抑制作用。方法:1.选取GEO（Gene Expression Omnibus）数据库中胰腺癌基因表达谱数据集（GSE71729、GSE62165、GSE15471和GSE11838）,以P values<0.01和log Fold Change>2为条件,比较胰腺癌与正常胰腺组织的差异基因（differentially expressed genes,DEGs）表达情况、EMT激活情况密切相关的基因集（HALLMARK-EPITHELIAL-MESENCHYMAL-TRANSITION）富集情况（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）分析,并使用TCGA（The Cancer Genome Atlas）数据库,通过Kaplan-Meier生存分析法,评估所筛选出的差异基因与胰腺癌患者生存预后的关系。2.对胰腺癌组织芯片（HPan-Ade170Sur-01,包含99例胰腺癌患者标本及71例癌旁组织）进行免疫组织化学染色;采用Image-Pro Plus软件对ALDH1A3的表达进行量化分析;经列联表分析、单因素/多因素方差分析及Kaplan-Meier生存分析,评估ALDH1A3的表达与胰腺癌患者临床病理参数及生存预后的关系。3.慢病毒shRNA（Short hairpin RNA）敲低胰腺癌细胞系（CAPAN1、HS766T、PANC1）中ALDH1A3的表达,RT-PCR、Western Blot实验验证敲低效率后,通过四唑化合物（methyl-thiazolyldiphenyl-sulfophenyl-tetrazolium bromide,MTS）比色法检测细胞增殖能力的变化,平板克隆形成实验检测细胞群体依赖性和增殖能力的变化,Transwell实验评估侵袭迁移能力的变化。4.RT-PCR、Western Blot法检测上述细胞系中EMT相关基因的mRNA（CDH1、CDH2、SNAI1、SNAI2、VIM、ZEB1、ZEB2、CTNNB1、TWIST1、SIP1）及蛋白（E-cadherin、N-cadherin、Snail1）表达水平。5.微量热泳动（Microscale Thermophoresis,MST）实验和等温滴定量热技术（Isothermal Titration Calorimetry,ITC）验证小分子抑制剂YD1701与ALDH1A3重组蛋白的特异性结合;热漂移实验评估小分子抑制剂在胰腺癌细胞内与ALDH1A3蛋白的特异性结合;酶活性检测方法计算YD1701对ALDH1A3酶活性抑制的IC50值。6.采用MTS实验检测YD1701对正常胰腺癌上皮细胞（HpDE6-C7）及胰腺癌细胞（CAPAN1）的IC50值;Transwell实验评估YD1701对胰腺癌细胞侵袭迁移能力的抑制作用;建立小鼠皮下及原位胰腺癌移植瘤模型;经腹腔注射小分子抑制剂观察其对肿瘤生长、远处转移的抑制效应,以及对小鼠荷瘤生存时间的影响;利用苏木精-伊红染色法及免疫组织化学染色,观察YD1701对肿瘤生长的抑制效应、对远处转移的抑制效应。7.采用SPSS 22.0统计软件和GraphPad Prism 5对实验数据进行处理,数据用?±s表示,组间比较用独立样本t检验进行;Kaplan-Meier生存分析应用Log-Rank检验;列联表分析采用χ2检验;预后预测因子的单因素/多因素方差分析采用Cox比例风险回归模型:模型检验采用似然比检验,参数估计采用最大似然法,参数检验采用Wald检验。检验水准:α=0.05。结果:1.EMT相关基因集在ALDH1A3高表达的胰腺癌患者中富集选取GEO数据库中GSE71729、GSE62165、GSE15471和GSE11838四个数据集,筛选胰腺癌与正常胰腺组织的差异基因,然后比较上述四个数据集中EMT相关基因（GSEA,HALLMARK-EPITHELIAL-MESENCHYMAL-TRANSITION）的表达情况,共获得19个共同的差异基因（包含ALDH1A3）。分析TCGA胰腺癌RNA测序数据,发现ALDH1A3高表达患者EMT通路显著富集（NES=2.03,FDR=0.004）,且ALDH1A3高表达胰腺癌患者的生存时间（中位生存时间660天,n=86）较低表达患者（中位生存时间840天,n=84）明显缩短（Log-rank检验,P=0.029）。2.敲低ALDH1A3抑制胰腺癌细胞的侵袭及EMT相关转录因子的表达2.1 ALDH1A3抑制胰腺癌的侵袭迁移敲低胰腺癌细胞系中的ALDH1A3后,细胞形态明显改变,主要表现为:（1）细胞突起数量减少;（2）细胞形状由长梭形纤维样细胞变为多边形的上皮样细胞。Transwell实验检测发现其侵袭迁移能力显著降低。2.2 ALDH1A3可能通过Snail1/E-cadherin途径调控胰腺癌EMT过程胰腺癌细胞系（ASPC1、CAPAN1、HS766T、SW1990、PANC1）中ALDH1A3的蛋白表达水平均高于正常胰腺上皮细胞（HpDE6-C7）。敲低ALDH1A3后,EMT相关基因发生显著变化,其中E-cadherin表达升高,N-cadherin、Snail1与Slug表达均降低。3.ALDH1A3高表达与胰腺癌患者的转移及不良预后显著相关免疫组织化学染色方法对胰腺癌组织芯片分析发现:与癌旁组织（4.752±0.1688,n=71）相比,ALDH1A3在胰腺癌组织中（5.537±0.1363,n=98）的蛋白表达水平显著升高（独立样本t检验,P=0.0004）。ALDH1A3的表达水平与胰腺癌患者临床分期（P=0.0136）密切相关。基于Cox比例风险回归模型的多因素生存分析发现,ALDH1A3蛋白高表达的胰腺癌患者预后不良:ALDH1A3高表达胰腺癌患者的中位生存期为10个月,而ALDH1A3低表达胰腺癌患者的中位生存期为17个月（风险比为1.70,95%置信区间为1.0732.327,P=0.0475）。4.小分子抑制剂YD1701能够与ALDH1A3特异性结合并抑制其酶活性通过MST实验(Kd=9.75×10-6)、ITC实验(N:2.02±0.0797 Sites;K:7.36 E5±1.61E5 M-1;ΔH:2.441 E4±1478 cal/mol;ΔS:109 cal/mol/deg)证明小分子YD1701能够与ALDH1A3重组蛋白发生特异性结合;热漂移实验证实YD1701能够在细胞内与ALDH1A3特异性结合,最大结合强度=0.5867;检测YD1701对ALDH1A3酶活性抑制的IC50值=22.5161μM。5.ALDH1A3特异性小分子抑制剂YD1701抑制胰腺癌的转移YD1701对正常胰腺导管上皮细胞（HpDE6-C7）的IC50=663.195μM;对胰腺癌细胞系（CAPAN1）的IC50=103.851μM。体外实验证实:YD1701处理后,胰腺癌细胞的迁移能力显著下降。构建小鼠皮下移植瘤模型及原位胰腺癌模型,腹腔注射不同浓度的小分子抑制剂YD1701（25 mg/kg、10 mg/kg和1 mg/kg）,发现10 mg/kg的YD1701可降低胰腺癌小鼠原位移植瘤的肺转移率（阴性对照组vs.中剂量组:87.5%（7/8例）vs.12.5%（1/8例））,并延长小鼠荷瘤生存期（阴性对照组vs.中剂量组:n=8,37天vs.47.5天,P=0.002）。结论:1.ALDH1A3高表达可作为胰腺癌患者的预后不良因素。2.ALDH1A3可能通过Snail1/E-cadherin途径调控EMT通路从而促进胰腺癌的侵袭转移。3.小分子抑制剂YD1701可特异性地结合ALDH1A3并抑制其酶活性。4.小分子抑制剂YD1701可抑制胰腺癌转移,有望成为治疗胰腺癌的候选分子。